利咽解毒方防治大鼠急性放射性口腔黏膜炎作用機(jī)制的研究*

張 紅 張志芳 唐利文

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

急性放射性口腔黏膜炎（ROM）是頭頸部惡性腫瘤放射治療的主要?jiǎng)┝肯拗埔蛩丶芭R床亟待解決的問題之一，發(fā)病機(jī)制尚不明確，涉及多種細(xì)胞因子及蛋白的參與［1-3］。 中醫(yī)藥治療取得了不錯(cuò)的效果［4-6］。 利咽解毒方為我院學(xué)術(shù)帶頭人、本文第二作者張志芳教授的自擬方，也是本院治療ROM的常用方。本實(shí)驗(yàn)擬觀察利咽解毒方對(duì)ROM的影響，以進(jìn)一步指導(dǎo)臨床研究，提高急性ROM中醫(yī)治療水平?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠50只，鼠齡10～11周，體質(zhì)量（220±10）g（湖南中醫(yī)藥大學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），雌雄各半，在干燥、空氣流通、12 h光暗交替的條件下自由進(jìn)食水、食，所有動(dòng)物在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前均環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以上，以最大限度降低動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾。

1.2 藥物與制備 利咽解毒方所用藥物按處方量一次性購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。將藥物按比例稱取后，水煎，過濾，濃縮，裝入瓶中密封保存于4℃冰箱中，灌胃時(shí)水浴至36℃。根據(jù)“常用動(dòng)物與人體表面積比值表”計(jì)算，高劑量組每毫升藥液含生藥0.21 g（相當(dāng)于臨床用量的20倍），低劑量組每毫升藥液含生藥0.11 g（相當(dāng)于臨床用量的10倍）

1.3 試劑與儀器 兔抗缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）多克隆抗體；兔抗環(huán)氧化酶-2（COX-2）多克隆抗體；兔抗白介素-6（IL-6）多克隆抗體；即用型SABC免疫組化試劑盒；DAB濃縮顯色試劑盒 （以上所有試劑均由武漢博士德生物工程有限公司提供）。

1.4 分組與造模 將大鼠隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、西藥組、低劑量利咽解毒方組（簡稱低劑量組）和高劑量利咽解毒方組（簡稱高劑量組），每組10只。除空白組不予特殊處理外，其余4組實(shí)驗(yàn)組大鼠均予等劑量、等照射野和等源距的γ線照射。具體方法為：將大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL/kg）麻醉后，固定在自制的固定夾上，用開口器牽開口腔（口腔以外的部分用5 mm厚的自制鉛板防護(hù)裝置防護(hù)），用Co60遠(yuǎn)距離治療機(jī)的γ射線行頰部左右對(duì)穿照射，源皮距為80 cm，每次2 Gy，每日1次，每周5次，總劑量均為46 Gy。照射結(jié)束后立即對(duì)頰部給予生理鹽水濕潤，最大化減輕對(duì)頰黏膜的影響，并把大鼠置于潔凈的保溫盒內(nèi)待其自然蘇醒。

1.5 給藥方法 各組大鼠自造模前30 min用灌胃法給藥1次，給藥容量為10 mL/kg，每日3次，直至完成照射總劑量1周?？瞻捉M及模型組給予生理鹽水，高劑量組給予高劑量利咽解毒方（2.1 g/kg），低劑量組給予低劑量利咽解毒方（1.1 g/kg），西藥組給予西藥混合液（生理鹽水500 mL+利多卡因10 mL+慶大霉素8萬單位+地塞米松5 mg+滅滴靈0.8 mg+小蘇打2.0 mg）。

1.6 觀察指標(biāo) （1）動(dòng)物口腔黏膜的采集及觀察。完成照射總劑量1周后將大鼠斷頸處死，仔細(xì)解剖取下口腔頰部黏膜，在濾紙上鋪平，借助放大鏡取典型病變處組織，標(biāo)本一分為二，一半用甲醛固定 12～24 h，石蠟包埋，制成5～6μm切片，作蘇木精-伊紅染色及免疫組化用；另一半立即置液氮內(nèi)速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。在光學(xué)顯微鏡下觀察黏膜形態(tài)（黏膜上皮炎性細(xì)胞的多少，有無變性、壞死、潰瘍形成以及成纖維細(xì)胞、新生血管等肉芽組織的增生情況）改變。光學(xué)顯微鏡下口腔黏膜損傷程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部放射性口腔炎診斷標(biāo)準(zhǔn)（0級(jí)，口腔黏膜無炎性細(xì)胞、壞死、潰瘍等；Ⅰ級(jí)，口腔黏膜中有少數(shù)炎性細(xì)胞，無壞死及潰瘍；Ⅱ級(jí)，口腔黏膜有中量炎性細(xì)胞，無壞死及潰瘍；Ⅲ級(jí)，口腔黏膜上皮固有層有大量炎性細(xì)胞浸潤，小面積壞死，無明顯潰瘍；Ⅳ級(jí)，口腔黏膜大面積潰瘍，有壞死組織，其周圍有成纖維細(xì)胞、新生毛細(xì)血管等）。（2）免疫組化染色劑分析。對(duì)頰黏膜組織進(jìn)行HE染色后，參照何迎春［7］免疫組化方法進(jìn)行制片機(jī)染色等，攝像后，Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行分析，測定病變組織中HIF-1α、COX、IL-6的蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，采用多組均數(shù)比較的方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠口腔黏膜形態(tài)分級(jí) 大鼠急性ROM模型建立后，正常大鼠頰黏膜呈粉紅色，表面濕潤，物紅腫潰瘍。模型組大鼠接受照射第3周開始出現(xiàn)肉眼可見的紅斑，黏膜下出現(xiàn)充血，隨著放療進(jìn)行可看到潰瘍加重，增多，并聯(lián)合成片，纖維滲出，形成黃白色假膜，到放療后第7日，所有受照射的部位形成片狀潰瘍。中藥低劑量及高劑量組與西藥組潰瘍出現(xiàn)情況晚，放療結(jié)束后逐漸開始出現(xiàn)，癥狀輕，放療結(jié)束后第7日對(duì)各組大鼠頰黏膜形態(tài)進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察，ROM分級(jí)情況見表1。

表1 各組大鼠放療后頰黏膜形態(tài)分級(jí)（n）

2.2 各組大鼠急性ROM頰黏膜組織中HIF-1α、COX、IL-6表達(dá)的比較 見圖1~圖3，表2。正常組織不表達(dá)或很微弱表達(dá)HIF-1α、COX、IL-6，模型組頰黏膜組織及其間質(zhì)可見大片或團(tuán)狀分布的棕黃色顆粒，低劑量組、高劑量組、西藥組HIF-1α、COX、IL-6陽性表達(dá)細(xì)胞明顯減少，均低于模型組（P＜0.05）。利咽解毒方低劑量及高劑量組與西藥組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中低劑量組蛋白陽性表達(dá)均高于高劑量組（P＜0.05）。

圖1 各組HIF-1α免疫組化染色光鏡圖（200倍）

圖2 各組COX-2免疫組化染色光鏡圖（200倍）

圖3 各組IL-6免疫組化染色光鏡圖（200倍）

表2 各組ROM頰黏膜組織HIF-1α、COX-2、IL-6表達(dá)水平

表2 各組ROM頰黏膜組織HIF-1α、COX-2、IL-6表達(dá)水平

與模型組比較，*P＜0.05；與西藥組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05。

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3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)目前對(duì)急性ROM的防治沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和特效藥，雖取得了一定療效，但長期療效均不甚理想［7-11］。

急性 ROM 發(fā)病過程中，HIF-1α、COX、IL-6發(fā)揮了重要作用。有實(shí)驗(yàn)表明，HIF-1α在正常的頰黏膜組織中幾乎不表達(dá)，而在ROM炎癥組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，說明HIF-1α參與了ROM的發(fā)病過程［12］。COX-2在正常頰黏膜組織中幾乎不表達(dá)，而在ROM炎癥組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，在一定程度上體現(xiàn)著ROM病程的炎癥狀態(tài)［13］。IL-6是放射性損傷最主要的相關(guān)因子之一，它除對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞具有直接地激活和毒性作用外，更主要是誘導(dǎo)急性期蛋白的合成，催化和放大炎性反應(yīng)和毒性作用，造成組織細(xì)胞的損害，其表達(dá)水平與炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度有密切的相關(guān)性。實(shí) 驗(yàn) 研 究 證 明［17］，IL-6 與 ROM 關(guān) 系 密 切［14-15］， 抑 制IL-6的過量生成，可能會(huì)減輕免疫反應(yīng)導(dǎo)致的上皮組織破壞。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為ROM屬“口瘡”、“口糜”等范疇，惡性腫瘤患者機(jī)體正虛邪實(shí)，瘀毒內(nèi)結(jié)加之屬火毒之邪的放射線，因此其病機(jī)關(guān)鍵為“虛”（氣陰兩虛）、“火”（實(shí)火、虛火）、“瘀”（氣滯血瘀、氣虛血瘀），虛、火、瘀三者互為因果，相互交結(jié)貫穿本病的始終，熱毒之邪入血分，聚于局部，腐蝕血肉發(fā)為癰腫瘡瘍。利咽解毒方由虎杖、苦參、生地黃、山茱萸、射干、薄荷組成，旨在養(yǎng)陰清熱、解毒利咽。方中生地黃清熱涼血，養(yǎng)陰生津；苦參、虎杖清熱解毒；射干、薄荷解毒利咽；山茱萸收斂創(chuàng)面，組方應(yīng)用符合中醫(yī)理論體系，貼近本病治療實(shí)際，在臨床上行之有效，而中醫(yī)治療ROM的機(jī)理研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各用藥組HIF-1α、COX、IL-6表達(dá)較模型組均低，說明HIF-1α、COX、IL-6三者可能介導(dǎo)了急性ROM的發(fā)生發(fā)展過程，利咽解毒方通過減少組織間HIF-1α、COX、IL-6的表達(dá)發(fā)揮其抑制效應(yīng)，其中利咽解毒方低劑量組和高劑量組又低于西藥治療組，說明利咽解毒方具有確切明顯的抗炎療效，且未發(fā)現(xiàn)毒副作用，可以作為治療急性ROM的基礎(chǔ)方用于臨床，臨癥加減，提高放射性口腔黏膜炎的臨床療效。

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