雙酚A和壬基酚對河蜆呼吸代謝和抗氧化酶活性的影響

華南師范大學化學與環(huán)境學院//教育部環(huán)境理論化學重點實驗室，廣東 廣州 510006

雙酚A和壬基酚對河蜆呼吸代謝和抗氧化酶活性的影響

曾麗璇，張悅君，康 園，張秋云

華南師范大學化學與環(huán)境學院//教育部環(huán)境理論化學重點實驗室，廣東 廣州 510006

為了研究雙酚A(Bisphenol A，BPA)和壬基酚(Nonylphenol，NP)對河蜆(Corbicula fluminea) 呼吸代謝能力和抗氧化酶活性的影響，探討B(tài)PA和NP對河蜆的毒性作用。以河蜆為受試生物，采用半靜態(tài)染毒法，研究了BPA和NP對河蜆的單一毒性等級、聯(lián)合毒性作用類型和對河蜆耗氧率、排氨率以及抗氧化酶系統(tǒng)中SOD、CAT活性的影響。結(jié)果顯示：① BPA、NP對河蜆的半致死質(zhì)量濃度(96 h-LC50)分別為6.34和1.09 mg·L-1，毒性順序為NP＞BPA，二者均為高毒物質(zhì)；② BPA-NP對河蜆毒性作用類型為協(xié)同作用；③亞急性毒性指標耗氧率、排氨率以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)對BPA、NP及二者混合物均比較敏感，在本試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(BPA：0.63、0.79、1.59、3.17 mg·L-1；NP：0.109、0.136、0.271、0.542 mg·L-1；BPA+NP：(0.078 2+0.029)、(0.097 8+0.036 3)、(0.196+0.072 5)、(0.391+0.145) mg·L-1)，河蜆耗氧率、排氨率以及兩種酶活性變化均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，其中在BPA、NP和二者混合物的質(zhì)量濃度較低時，河蜆的耗氧率和排氨率、SOD和CAT活性只有微小降低，隨著質(zhì)量濃度的升高，河蜆耗氧率和排氨率、兩個酶活性相對均有所升高，而在質(zhì)量濃度極高時其耗氧率和排氨率以及兩個酶活性才又受到顯著性或極顯著性的抑制。實驗結(jié)果顯示河蜆耗氧率、排氨率和SOD、CAT活性對水體中酚類內(nèi)分泌干擾物反應敏感，具有較好的一致性和規(guī)律性，耗氧率、排氨率和SOD、CAT活性與其他敏感性指標一起可以作為酚類內(nèi)分泌干擾物污染的一項早期監(jiān)測指標。

雙酚A；壬基酚；河蜆；耗氧率；排氨率；SOD；CAT

酚類內(nèi)分泌干擾物(Phenolic endocrine disrupting chemicals，pEDCs)是內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals，EDCs)中，具有1-2個苯酚基團、苯環(huán)上結(jié)合了不同化學結(jié)構(gòu)取代基的化合物。其中的壬基酚(Nonylphenol，NP)和雙酚A(Bisphenol A，BPA)因在環(huán)境中廣泛存在而備受關(guān)注(牛海崗等，2009；Vandenberg等，2007)。

BPA、NP在環(huán)境中一般共存于水體、土壤和食品中(NASU等，2001；LAGAN等，2004；ZHANG等，2011)，通過接觸進入機體。目前關(guān)于BPA、NP對魚類、水蚤和海洋貝類等水生動物毒性效應的研究較多，但均為單一染毒的資料(Canesi等，2007；Segner等，2003；莊惠生和楊光，2005；Hasselberg等，2004；LI，2008)，關(guān)于二者混合對雙殼貝類的毒性研究相對較少。

河蜆(Corbicula fluminea) 原產(chǎn)我國，是一種主要棲息于淡水及咸淡水的江河、湖泊及入?？谥谐Ｒ姷碾p殼貝類，現(xiàn)已廣泛分布于世界各地的水域中，主要以水中的浮游生物(如硅藻、綠藻、原生動物、輪蟲等)為食料(Way等，1990)。已有報道用河蜆作為指示生物進行生態(tài)毒理學等的研究( Marie等，2006；Vidal等，2001)。

動物耗氧率(Oxygen Consumption Rate，OCR)和排氨率(Ammonia Excretory Rate，AER)的大小及變化能夠反映其呼吸代謝能力的高低及變化規(guī)律，因而常作為衡量動物能量消耗的一個指標，可以作為反映某些污染物毒性大小的敏感指標(Cheung和Cheung，1995)。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)是生物體內(nèi)廣泛存在的2個重要的抗氧化防御系統(tǒng)酶，它們的活性可作為生物逆境生理和衰老生理指標(Wang等，1989)。

為真實反映BPA和NP在環(huán)境中共存對雙殼貝類可能造成的毒性作用，本研究應用同批河蜆在同等條件下同時進行了BPA、NP單一染毒和混合染毒試驗，并通過不同質(zhì)量濃度的BPA、NP和二者混合物對河蜆抗氧化酶SOD和CAT活性，以及耗氧率和排氨率的大小的變化，來探明BPA、NP及二者混合物對河蜆抗氧化酶系統(tǒng)和呼吸代謝能力的毒性影響，以期為酚類內(nèi)分泌干擾物水質(zhì)標準的制定和建立早期生態(tài)預警體系提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：BSA1245S-CW電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；UV-3100PC紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；玻璃勻漿器。

試劑：雙酚A(國產(chǎn)分析純)；壬基酚(國產(chǎn)分析純)；乙醇(國產(chǎn)分析純)。

1.2 試驗動物

試驗所用河蜆來自珠江三角洲河網(wǎng)中水質(zhì)較好的增江。選取殼長(25.0±2.0) mm，殼高(19.40±0.20) mm，體質(zhì)量為(4.00±0.40) g 的健康河蜆用于試驗。河蜆用經(jīng)過3 d自然脫氯和已充分曝氣的自來水在試驗室暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)期間水溫為(20±1) ℃，自然光照。

1.3 試驗方法

1.3.1 急性毒性試驗

急性毒性采用半靜態(tài)換水式試驗，每24 h更換1次試驗液，換水后加入BPA至初始質(zhì)量濃度。試驗容器為定制的容積為1 L的玻璃水族箱，每升水中放10只河蜆，試驗期間不喂食，試驗條件控制在水溫(20±1) ℃，pH值為7.5～8.0，溶解氧為7～8 mg·L-1。預試驗設(shè)置3個間隔較大的質(zhì)量濃度梯度，每組設(shè)3個平行，求出48 h的100%死亡、無死亡和大致半致死質(zhì)量濃度。正式試驗按照預試驗所得結(jié)果設(shè)置4個質(zhì)量濃度試驗組和1個空白對照組、1個溶劑對照組(φ=0.1%的乙醇)，每組設(shè)3個平行。試驗期間連續(xù)觀察受試對象的活動情況，及時清除死亡的河蜆和代謝物，每隔24 h記錄河蜆的死亡情況。判斷個體死亡的標準：河蜆外膜收縮、刺激時腹足不能收縮、雙殼張開，多次用鑷子適度敲擊殼體，并夾緊雙殼而沒有自動閉殼反應作為死亡判斷標準。暴露96 h后計算其半致死質(zhì)量濃度(Median lethal concentration, LC50)。然后按下式計算安全質(zhì)量濃度(SC): SC = 96 h-LC50×0.01。

1.3.2 聯(lián)合急性毒性試驗

根據(jù)已有的實驗結(jié)果，BPA和NP對河蜆的96 h-LC50分別為6.34 mg·L-1和1.09 mg·L-1。聯(lián)合毒性作用類型采用等效應曲線法進行評價，將BPA和NP的96 h-LC50數(shù)值比為1:1時定義為一個毒性單位，分別配置0.25、0.50、0.75和1.00個毒性單位的混合染毒液，不同毒性單位的混合染毒液按照下式進行配置：

X毒性單位的混合染毒液=X(LC50-A+LC50-B)

A、B代表對河蜆進行聯(lián)合毒性試驗的2種污染物，X代表試驗中所使用的混合液配比，X為0.25、0.50、0.75和1.00。

1.3.3 亞急性毒性試驗

亞急性毒性試驗以單一污染物和2種污染物混合液96 h-LC50的1/10、1/8、1/4和1/2設(shè)置4個質(zhì)量濃度組，另設(shè)1個溶劑對照組(φ=0.1%的乙醇)，每組設(shè)3個平行，對河蜆進行為期7 d的亞急性染毒試驗，試驗采用半靜態(tài)換水，暴露期間的實驗方法與96h–LC50急性毒性試驗相同，每天觀察記錄河蜆的死亡情況，并及時清除死亡的河蜆和代謝物。

1.3.4 耗氧率和排氨率的測定

耗氧率和排氨率的測定采用劉其根等( 1999)的方法進行測定。根據(jù)試驗前后代謝瓶內(nèi)水中的溶解氧及氨氮含量，按下列公式計算河蜆的耗氧率和排氨率：

式中：OR為單位體質(zhì)量耗氧率，mg·g-1·h-1；DO0和DOt為試驗開始、在t時間結(jié)束時水中DO的含量，mg·L-1；V為代謝瓶中水的體積，L；W為河蜆質(zhì)量，g；t為試驗持續(xù)時間，h。

式中：NR為單位河蜆個體質(zhì)量排氨率，mg·g-1·h-1；N0和Nt為試驗開始、在t時間結(jié)束時水中NH3-N的質(zhì)量濃度，mg·L-1；V為代謝瓶中水的體積，L；W為河蜆質(zhì)量，g；t為試驗持續(xù)時間，h。

1.3.5 酶活性的測定

亞急性毒性試驗結(jié)束后，從各組中各取出數(shù)只河蜆盡快剖開，用濾紙對其吸干后，稱取軟體組織0.50 g用6.7×10-3mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0) 3.0 mL進行勻漿，勻漿液倒入離心管中，加3 mL磷酸鹽緩沖溶液沖洗勻漿器后，也倒入離心管中，在4000 r·min-1離心30 min，取上清液為粗酶液。

1）SOD活性的測定

SOD活力測定采用鄒國林等(1986)改進的鄰苯三酚自氧化法，波長λ=325 nm，酶活性單位定義為:每毫升反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量定義為一個酶活性單位。

2）CAT活性的測定

CAT活性測定采用徐鏡波和袁曉凡(1997)的紫外分光光度法進行測定，波長λ=240 nm，酶活性定義為：一個過氧化酶單位相當于在規(guī)定條件下，于25 ℃、pH=7.0，每分鐘分解1 μmol過氧化氫所需的酶量。

3）總蛋白含量的測定

蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford (1976)的方法，即考馬斯亮藍法。10.00 mL Bradford染色液加入0.30 mL待測蛋白，混勻后在595 nm處檢測吸光度。以牛血清白蛋白(BSA)為標準蛋白做出的標準曲線計算各樣本蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)均以3次平均數(shù)±標準偏差(mean±SD)表示；組間數(shù)據(jù)利用單因素方差分析(One-Way AVONA)和Duncan檢驗法在P=0.05的置信水平進行差異性分析；試驗所得結(jié)果用Origin8.0繪圖。

2 結(jié)果

2.1 單一急性毒性試驗

單一急性毒性試驗結(jié)束后，空白對照組以及溶劑對照組均無死亡。觀察發(fā)現(xiàn)，試驗期間未死亡個體的活動能力下降，用鑷子適度敲擊河蜆殼體時，其閉殼速度緩慢，用玻璃棒刺激河蜆的腹足時，其收縮速度緩慢，而且其外套膜邊緣有黏性絮狀物包被。BPA、NP對河蜆的急性毒性結(jié)果見表1。

在同一質(zhì)量濃度試驗組中，試驗時間與河蜆的死亡率呈正相關(guān)關(guān)系，即隨著暴露時間的延長河蜆死亡率均呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢。根據(jù)表1的試驗結(jié)果，可得到BPA對河蜆的96 h-LC50為6.34 mg·L-1，其安全質(zhì)量濃度為0.063 mg·L-1；NP對河蜆的96 h-LC50為1.09 mg·L-1，其安全質(zhì)量濃度為0.0109 mg·L-1。以單一化合物96 h-LC50(mg·L-1) 為毒性大小評判標準，2種酚類有機物的毒性大小順序為：NP＞BPA。

2.2 聯(lián)合急性毒性試驗

BPA和NP對河蜆的聯(lián)合急性毒性結(jié)果見表2，BPA和NP的聯(lián)合毒性作用等效應曲線見圖2。

由圖1可知BPA-NP對河蜆聯(lián)合作用的96 h-LC50落于95%置信區(qū)間下限線下側(cè)，故BPA-NP對河蜆聯(lián)合作用的類型為協(xié)同作用。

表1 BPA、NP對河蜆96 h的半致死質(zhì)量濃度Table1 96 h–LC50values of BPA and NP to Asian clam

表2 BPA-NP對河蜆96h的半致死質(zhì)量濃度Table2 96 h–LC50values of BPA-NP to Asian clam

2.3 亞急性毒性試驗

亞急性毒性試驗以BPA、NP和2種污染物混合液96 h-LC50的1/10、1/8、1/4和1/2設(shè)置4個質(zhì)量濃度組，即0.63、0.79、1.59、3.17 mg·L-1和0.109、0.136、0.271、0.542 mg·L-1以及(0.0782+0.029)、(0.0978+0.0363)、(0.196+0.0725)、(0.391+0.145) mg·L-1，7 d的亞急性毒性試驗結(jié)束后，溶劑對照組均無死亡，其他質(zhì)量濃度組死亡率均低于5%。

圖1 BPA-NP聯(lián)合毒性作用等效應曲線Fig.1 The joint toxic effect of equivalent curve for BPA-NP

2.3.1 BPA、NP及二者混合物對河蜆SOD活性的影響

BPA、NP及二者混合物對河蜆SOD活性的影響結(jié)果顯示(圖2)：在BPA、NP單一污染和混合污染暴露下，河蜆軟體組織SOD活性均表現(xiàn)為隨著污染物質(zhì)量濃度的升高SOD活性先降低后升高再降低。在質(zhì)量濃度為1/10 LC50時，BPA、NP單一脅迫的SOD活性均接近對照組水平，與對照組無顯著差異(P＞0.05)，但此時混合物脅迫的SOD活性顯著低于對照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/8 LC50時，BPA、NP單一脅迫的SOD活性均顯著低于對照組(P＜0.05)，而此時混合物脅迫的SOD活性極顯著低于對照組(P＜0.01)；在質(zhì)量濃度為1/4 LC50時，BPA單一脅迫的SOD活性顯著高于對照組(P＜0.05)，NP單一脅迫的SOD活性接近對照組水平，與對照組無顯著差異(P＞0.05)，但此時混合物脅迫的SOD活性顯著低于對照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/2 LC50時，BPA、NP單一脅迫的SOD活性均顯著低于對照組(P＜0.05)，但此時混合物脅迫的SOD活性極顯著低于對照組(P＜0.01)。

圖2 BPA和NP對河蜆SOD活性的影響Fig.2 Effects of BPA and NP on SOD activities of clams

圖3 BPA和NP對河蜆CAT活性的影響Fig. 3 Effects of BPA and NP on CAT activities of clams

圖4 BPA和NP對河蜆耗氧率的影響Fig.4 Effects of BPA and NP on OCR of clams

圖5 BPA和NP對河蜆排氨率的影響Fig.5 Effects of BPA and NP on AER of clams

2.3.2 BPA、NP及二者混合物對河蜆CAT活性的影響

BPA、NP及二者混合物對河蜆CAT活性的影響結(jié)果顯示(圖3)：在BPA、NP單一污染和混合污染暴露下，總體趨勢均為隨著污染物質(zhì)量濃度的升高CAT活性先降低后升高再降低，各質(zhì)量濃度組中CAT活性均低于對照組。在質(zhì)量濃度為1/10 LC50時，BPA、NP單一脅迫的CAT活性均低于對照組，與對照組無顯著差異(P＞0.05)，但此時混合物脅迫的CAT活性顯著低于對照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/8 LC50時，BPA、NP單一脅迫的CAT活性均顯著低于對照組(P＜0.05)，而此時混合物脅迫的CAT活性極顯著低于對照組(P＜0.01)；在質(zhì)量濃度為1/4 LC50時， BPA、NP單一脅迫的CAT活性均低于對照組，但與對照組無顯著差異(P＞0.05)，而此時混合物脅迫的CAT活性顯著低于對照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/2 LC50時，BPA、NP單一脅迫的CAT活性均顯著低于對照組(P＜0.05)，但此時混合物脅迫的CAT活性極顯著低于對照組(P＜0.01)。

2.3.3 BPA、NP及二者混合物對河蜆耗氧率的影響

BPA、NP及二者混合物對河蜆耗氧率的影響結(jié)果顯示(圖4)：在BPA、NP單一污染和混合污染暴露下，總體趨勢為隨著污染物質(zhì)量濃度的升高耗氧率先降低后升高再降低，各質(zhì)量濃度組中耗氧率均低于對照組。在質(zhì)量濃度為1/10 LC50時，BPA、NP單一脅迫和混合物脅迫的耗氧率均接近對照組水平，與對照組無顯著差異(P＞0.05)；在質(zhì)量濃度為1/8 LC50時，BPA、NP單一脅迫和混合物脅迫的耗氧率均極顯著低于對照組(P＜0.01)；在質(zhì)量濃度為1/4 LC50時，BPA單一脅迫和混合物脅迫的耗氧率顯著低于對照組(P＜0.05)，NP單一脅迫的耗氧率極顯著低于對照組(P＜0.01)；在質(zhì)量濃度為1/2 LC50時，BPA、NP單一脅迫和混合物脅迫的耗氧率均極顯著低于對照組(P＜0.01)。

2.3.4 BPA、NP及二者混合物對河蜆排氨率的影響

BPA、NP及二者混合物對河蜆排氨率的影響結(jié)果顯示(圖5)：在BPA、NP單一污染和混合污染暴露下，總體趨勢為隨著污染物質(zhì)量濃度的升高排氨率先降低后升高再降低，各質(zhì)量濃度組中排氨率均低于對照組。在質(zhì)量濃度為1/10 LC50時，BPA的排氨率接近對照組水平，與對照組無顯著差異(P＞0.05)，NP單一脅迫和混合物脅迫則顯著低于對照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/8 LC50時，BPA、NP單一脅迫和混合物脅迫的排氨率均極顯著低于對照組(P＜0.01)；在質(zhì)量濃度為1/4 LC50時，BPA、NP單一脅迫和混合物脅迫的排氨率均顯著低于對照組(P＜0.05)；在質(zhì)量濃度為1/2 LC50時，BPA單一脅迫和混合物脅迫的排氨率顯著低于對照組(P＜0.05)，NP單一脅迫的排氨率極顯著低于對照組(P＜0.01)。

3 討論

3.1 BPA、NP對河蜆的96 h-LC50

BPA對河蜆的96 h-LC50為6.34 mg·L-1；NP對河蜆的96 h-LC50為1.09 mg·L-1，Pascoe等 (2002)報道了BPA對水螅96 h-LC50為6.9 mg·L-1；郭匿春和謝平(2009)報道了BPA對隆線溞和微型裸腹?溞48 h-LC50分別為11.64、9.63 mg·L-1，NP對隆線溞和微型裸腹溞48 h-LC50分別為0.159、0.126 mg·L-1。由此可知受試生物不同，相同污染物對水生生物的LC50不同；不同污染物對同種水生生物的LC50也不同，這是由于不同水生生物對污染物的耐受性不同，相同水生生物對不同污染物的耐受性不同造成的。

化學物質(zhì)對生物的毒性作用可根據(jù)其96 h-LC50分為4個等級(國家環(huán)境保護總局，2004)：LC50＜1 mg·L-1為極高；LC50=1～10 mg·L-1為高毒；LC50=10～100 mg·L-1為中毒；LC50＞100 mg·L-1為低毒。參照此毒性分級標準，BPA (96 h-LC50為6.34 mg·L-1)和NP (96 h-LC50為1.09 mg·L-1)對河蜆均屬于高毒等級。河蜆對BPA和NP的耐受順序為：BPA＞NP。

3.2 BPA、NP對河蜆的聯(lián)合作用

BPA-NP對河蜆的96 h-LC50聯(lián)合作用的類型為協(xié)同作用。在質(zhì)量濃度均為一定比例的BPA、NP和二者混合物的96 h-LC50條件下，河蜆呼吸代謝能力差異不明顯，但其抗氧化酶活性已有顯著區(qū)別。BPA、NP單一暴露的情況下，河蜆的SOD和CAT活性與對照組相比略有不同，但是差異并不十分明顯。而一旦在兩種污染物聯(lián)合暴露下，會極其顯著地抑制河蜆抗氧化酶活性。說明兩種污染物的協(xié)同作用最先表現(xiàn)在對機體抗氧化酶系統(tǒng)的破壞，進而影響生物體的呼吸代謝能力。

3.3 BPA、NP及二者混合物對河蜆抗氧化酶和呼吸代謝能力的影響

在污染物脅迫下，生物體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性氧等自由基，若不及時清除，會破壞生物體內(nèi)的活性氧平衡，從而對生物體造成氧化損傷，進而影響生物體呼吸代謝能力。SOD和CAT作為生物體抗氧化應激的第一道防線，通常會共同起作用，用以清除生物體內(nèi)因污染脅迫產(chǎn)生的自由基。SOD酶是一類以O(shè)2-為底物的金屬酶，是抗氧化防御系統(tǒng)酶中最先起作用的一環(huán)，能夠催化生物體內(nèi)超氧陰離子自由基(O2-)發(fā)生歧化反應：2O2-+2H+H2O2+ O2，使自由基分解成小分子產(chǎn)物，從而抑制了O2-·向活性最高的自由基·OH的轉(zhuǎn)化(KEHRER, 2000)，而CAT酶作為過氧化物酶中的代表酶，可以將SOD酶的分解產(chǎn)物H2O2繼續(xù)分解成對機體無害的產(chǎn)物H2O和O2：2H2O22H2O+ O2，從而起到保護機體免受外界氧化損傷的作用。

早有研究報道, 生物體內(nèi)呼吸代謝和抗氧化成分等會因污染脅迫的存在而改變(Cheung和Cheung，1995；Rodriguez-Ariza等，1993)。前人曾經(jīng)做過BPA、NP短期暴露影響水生生物呼吸代謝和酶學指標的研究。為研究BPA對生物抗氧化還原系統(tǒng)的影響，意大利的研究者Canesi等( 2007)研究了注射BPA (3～60 ng/g dw tissue) 24 h之后，海產(chǎn)雙殼貝類Mytilus galloprovincialis Lam.的氧化還原狀況的變化時發(fā)現(xiàn)，BPA改變了包括CAT酶、GST酶的活性以及總谷胱甘肽的含量。Li Mei-Hui研究了包括壬基酚在內(nèi)的8種離子和非離子表面活性劑對一種淡水渦蟲的急性毒性及CAT酶、SOD酶以及膽堿酯酶活性的影響，結(jié)果顯示，0.5 mg·L-1的壬基酚使SOD酶及膽堿酯酶的活性受到抑制(Li，2008)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，BPA、NP及二者混合物均可對河蜆抗氧化酶及呼吸代謝能力產(chǎn)生一定的抑制作用，這與前人的研究結(jié)果較為一致。

本試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，在BPA、NP單一暴露及聯(lián)合暴露下，河蜆耗氧率和排氨率、SOD和CAT活性均呈現(xiàn)出先下降后上升再下降的趨勢，其中在BPA、NP和二者混合物的質(zhì)量濃度較低時，河蜆的耗氧率和排氨率、SOD和CAT活性只有微小降低，隨著質(zhì)量濃度的升高，河蜆耗氧率和排氨率、兩個酶活性相對均有所升高，而在質(zhì)量濃度極高時其耗氧率和排氨率以及兩個酶活性才又受到顯著性或極顯著性的抑制，這可能是由于在較低的質(zhì)量濃度暴露下，活性氧等自由基，包括氧自由基(O2-)、氫過氧自由基(HO2-·)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(OH·)等在體內(nèi)不斷積累，導致細胞受到一定程度的氧化損傷，而此時機體內(nèi)抗氧化酶防御系統(tǒng)等功能尚未被激活，從而導致機體酶活性降低，而自由基積累，加劇了膜脂過氧化，使膜的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，因而引起一系列生理生化代謝紊亂，機體生理代謝功能降低(Cheung和Cheung，1995)，表現(xiàn)為河蜆耗氧率和排氨率的降低；當污染物的質(zhì)量濃度逐漸升高時，體內(nèi)抗氧化作用的酶防御系統(tǒng)(如SOD酶和CAT酶)通過細胞應激作用產(chǎn)生大量的酶蛋白，從而使得體內(nèi)相關(guān)酶活性有所升高，SOD酶和CAT酶活力的提高可以清除代謝中產(chǎn)生的H2O2, 使生物體不受到較大的氧化損傷，呼吸排泄能力亦有所增強；但當污染物的質(zhì)量濃度再次升高并達到一定閾值時，推測由于機體所含有的自由基已遠遠高于酶系統(tǒng)的清除能力，導致體內(nèi)自由基不斷積累，細胞受到更為嚴重的損傷，與此同時機體抗氧化作用的酶防御系統(tǒng)也瀕于崩潰，表現(xiàn)為機體相關(guān)酶活性的降低，生理代謝功能下降。

4 結(jié)論

1) BPA和NP對河蜆屬于高等毒性的物質(zhì)，且NP對河蜆的毒性高于BPA。

2) BPA和NP共存時，對河蜆聯(lián)合作用為毒性增加的協(xié)同作用。

3) 實驗研究了在BPA、NP單一暴露及聯(lián)合暴露下，河蜆抗氧化酶活性和呼吸代謝能力的變化規(guī)律，探討了以抗氧化酶和耗氧率、排氨率作為污染監(jiān)測指標的可能性。結(jié)果表明，在BPA和NP的單一作用及二者聯(lián)合作用下，SOD、CAT活性和耗氧率、排氨率均表現(xiàn)出相似的變化趨勢，具有較好的一致性和規(guī)律性，而且對BPA和NP的反應都比較敏感。因此，可以聯(lián)合河蜆呼吸和排泄過程中的耗氧率和排氨率以及兩種酶活性變化作為BPA和NP單一污染及聯(lián)合污染的一項早期監(jiān)測指標，用來反映水體中BPA和NP的污染狀況。

BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1): 248-254.

CANESI L, BORGHI C, CIACCI C, et al. Bisphenol-A alters gene expression and functional parameters in molluscan hepatopancreas[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2007, 276(1): 36-44.

CHEUNG S G, CHEUNG R Y H. Effects of heavy metals on oxygen consumption and ammonia excretion in green-lipped mussels (Perna viridis) [J]. Marine Pollution Bulletin, 1995, 31(4): 381-386.

HASSELBERG L, MEIER S, SVARDAL A. Effects of alkylphenols on redox status in first spawning Atlantic cod (Gadus morhua)[J]. Aquatic Toxicology, 2004, 69(1): 95-105.

KEHRER J P. The Haber–Weiss reaction and mechanisms of toxicity[J]. Toxicology, 2000, 149(1): 43-50.

LAGAN A, BACALONI A, LEVA I De, et al. Analytical methodologies for determining the occurrence of endocrine disrupting chemicals in sewage treatment plants and natural waters[J]. Analytica Chimica Acta, 2004, 501(1): 79-88.

LI M H. Effects of nonionic and ionic surfactants on survival, oxidative stress, and cholinesterase activity of planarian[J]. Chemosphere, 2008, 70(10): 1796-1803.

MARIE V, BAUDRIMONT M, BOUDOU A. Cadmium and zinc bioaccumulation and metallothionein response in two freshwater bivalves (Corbicula fluminea and Dreissena polymorpha) transplanted along a polymetallic gradient[J]. Chemosphere, 2006, 65(4): 609-617 .

NASU M, GOTO M, KATO H, et al. Study on endocrine disrupting chemicals in wastewater treatment plants[J]. Water Science and Technology, 2001, 43(2): 101-108.

PASCOE D, CARROLL K, KAMTANUT W, et al. Toxicity of 17α-ethinylestradiol and bisphenol A to the freshwater cnidarian Hydra vulgaris[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2002, 43(1): 56-63.

RODRIGUEZ-ARIZA A, PEINADO J, PUEYO C, et al. Biochemical indicators of oxidative stress in fish from polluted littoral areas[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1993, 50(12): 2568-2573.

SEGNER H, NAVAS J M, SCHAFERS C, et al. Potencies of estrogenic compounds in in vitro screening assays and in life cycle tests with zebrafish in vivo[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2003, 54(3): 315-322.

VANDENBERG L N, HAUSER R, MARCUS M, et al. Human exposure to bisphenol A (BPA) [J]. Reproductive Toxicology, 2007, 24(2): 139-177.

VIDAL M L, BASSERES A, NARBONNE J F. Potential biomarkers of trichloroethylene and toluene exposure in Corbicula fluminea[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2001, 9(3): 87-97.

WANG J H, LIU H X, XU T. The role of superoxide dismutase (SOD) in stress physiology and senescence physiology of plant [J]. Plant Physiology Communications, 1989. 1.

WAY C M, HORNBACH D J, MILLER-WAY C A, et al. Dynamics of filter feeding in Corbicula fluminea (Bivalvia: Corbiculidae) [J]. Canadian Journal of Zoology, 1990, 68(1): 115-120.

ZHANG Y Z, SONG X F, KONDOH A, et al. Behavior, mass inventories and modeling evaluation of xenobiotic endocrine-disrupting chemicals along an urban receiving wastewater river in Henan Province, China[J]. Water Research, 2011, 45(1): 292-302.

郭匿春, 謝平. 雙酚 A 和壬基酚對隆線溞和微型裸腹溞的毒性[J]. 水生生物學報, 2009, 33(3): 492-497.

國家環(huán)境保護總局. HJ/T 154-2004新化學物質(zhì)危害評估導則[S]. 北京:中國環(huán)境科學出版社, 2004: 12.

劉其根, 沈和定, 周洪琪, 等. 河蜆的耗氧率和排氨率[J]. 上海水產(chǎn)大學學報, 1999, 8(4): 298-303.

牛海崗, 王宏元, 張育輝. 雙酚A對中國林蛙蝌蚪生長發(fā)育的毒性效應[J]. 生態(tài)毒理學報, 2009, 4(3): 408-414.

徐鏡波, 袁曉凡. 過氧化氫酶活性及活性抑制的紫外分光光度測定[J].環(huán)境化學, 1997, 16(1): 73-76.

莊惠生, 楊光. 雙酚 A 對鯉魚急性和亞急性毒性的研究[J]. 環(huán)境化學, 2005, 24(6): 682-684.

鄒國林, 桂興芬, 鐘曉凌. 一種 SOD 的測活方法-鄰苯三酚自氧化法的改進[J]. 生物化學與生物物理進展, 1986, 4(4): 71-73.

Effects of BPA and NP on respiratory metabolism and antioxidant enzymes in Asian calm

ZENG Lixuan, ZHANG Yuejun, KANG Yuan, ZHANG Qiuyun
Key Laboratory of Theoretical Chemistry of Environment, Ministry of Education, School of Chemistry and Environment, South China Normal University, Guangzhou 510006, China

In the present study, the effect of BPA and NP on respiratory metabolism and antioxidant enzymes in Asian clam (Corbicula fluminea) including oxygen consumption rate (OCR), the ammonia excretory rate (AER), and the activity of antioxidant enzymes (superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT)) were studied by semi-static method test．The results showed that: ① the 96 h-LC50of BPA and NP were 6.34 and 1.09 mg·L-1, respectively, and they were both categorized as high toxic substances; ② BPA and NP had a synergistic effect on chronic and acute toxicity; ③ In the range of the experimental concentrations(BPA：0.63, 0.79 , 1.59, 3.17 mg·L-1；NP：0.109, 0.136, 0.271, 0.542 mg·L-1；BPA+NP：(0.078 2+0.029), (0.097 8+0.036 3), (0.196+0.072 5), (0.391+0.145) mg·L-1), the response of OCR, AER, SOD and CAT to BPA and NP showed a typical pattern. There was only a minor decrease for the OCR, AER, SOD and CAT at low concentrations of BPA, NP and the mixture, and these activities were up-regulated as the concentrations of pollutants were increased, but they were significantly inhibited when the concentration of pollutants were increased up to 1/2 LC50. The present studies indicated that the OCR, AER, SOD and CAT in clams could be considered as an indicator for pEDCs pollution in early stage.

bisphenol a; nonylphenol; Asian clam (Corbicula fluminea); oxygen consumption rate (OCR); ammonia excretory rate (AER); superoxide dismutase (SOD); catalase (CAT)

X503.225

A

1674-5906（2014）01-0122-07

曾麗璇，張悅君，康園，張秋云. 雙酚A和壬基酚對河蜆呼吸代謝和抗氧化酶活性的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學報, 2014, 23(1): 122-128.

ZENG Lixuan, ZHANG Yuejun, KANG Yuan, ZHANG Qiuyun. Effects of BPA and NP on respiratory metabolism and antioxidant enzymes in Asian calm [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(1): 122-128.

國家自然科學基金項目(21147003)

曾麗璇(1972年生)，女，副教授，博士，研究方向為環(huán)境生態(tài)及水污染治理。E-mail: zenglx@scnu.edu.cn

2013-10-11