星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法優(yōu)選陜產(chǎn)鐵筷子皂苷提取工藝

王月茹謝 偉張 建席鵬洲

（1陜西國際商貿(mào)學(xué)院，咸陽，712046；2陜西步長制藥有限公司，西安，710075）

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法優(yōu)選陜產(chǎn)鐵筷子皂苷提取工藝

王月茹1謝 偉2張 建2席鵬洲2

（1陜西國際商貿(mào)學(xué)院，咸陽，712046；2陜西步長制藥有限公司，西安，710075）

目的：采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法優(yōu)化陜產(chǎn)鐵筷子皂苷的醇提取工藝。方法：選用乙醇為提取溶劑，以乙醇濃度、乙醇倍數(shù)、提取時(shí)間為自變量，鐵筷子皂苷含量為因變量，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化該藥材的提取工藝參數(shù)。結(jié)果：確定了提取工藝的最佳條件為：乙醇濃度70%，提取時(shí)間2 h，乙醇倍數(shù)6.5倍。在此條件下鐵筷子提取物中皂苷的含量為0.065 8 gg，二項(xiàng)式擬合復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0.847 5。結(jié)論：該工藝方法能夠用于陜產(chǎn)鐵筷子皂苷的提取，并且具有簡單、可行，預(yù)測性較好優(yōu)勢。

鐵筷子；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；響應(yīng)面；提取工藝

鐵筷子（Helleborus thibetanus Franch）為茛科鐵筷子屬的草本植物，別名黑毛七、見春花、九百棒，經(jīng)考，諸歷代本草文獻(xiàn)認(rèn)為鐵筷子主要有兩種：毛茛科植物鐵筷子和臘梅科植物臘梅根，陜西生長的中藥鐵筷子為毛茛科植物鐵筷子的干燥根及根莖，其主要功效有：清熱解毒，活血散瘀，消腫止痛。主治膀胱炎、尿道炎、瘡癤腫毒、跌打損傷、勞傷［1-2］。目前，關(guān)于陜產(chǎn)鐵筷子皂苷提取工藝的相關(guān)報(bào)道較少，在藥學(xué)制劑工藝和處方篩選過程中，常需同時(shí)考察多個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)因素水平數(shù)較多時(shí)，考慮到試驗(yàn)成本和試驗(yàn)周期，需采用試驗(yàn)次數(shù)較少的試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化法。國內(nèi)現(xiàn)在用得比較成熟的方法為均勻設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。雖然，上述兩種方法在試驗(yàn)處理時(shí)可以取得較佳點(diǎn)，基本可以滿足一般試驗(yàn)的要求。但是它們還存在一些問題，如試驗(yàn)的精度不夠，選擇的試驗(yàn)取值僅僅是接近最佳取值，無法精確找到最佳點(diǎn)；條件優(yōu)選憑經(jīng)驗(yàn)，不能靈敏地考察各因素間的交互作用等等。鑒于以上問題，為了更加優(yōu)選出鐵筷子總皂苷的提取工藝，筆者在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用國內(nèi)外近年來常用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體的星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，星點(diǎn)設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）是一種新型的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，簡單地說，效應(yīng)面優(yōu)化法就是通過擬合效應(yīng)變量對(duì)考察因素變量的效應(yīng)面，即函數(shù)f可以用某一數(shù)學(xué)模型f'近似地模擬函數(shù)，依據(jù)該模型可以描繪效應(yīng)面，從效應(yīng)面上選擇最優(yōu)的效應(yīng)域，利用f'求得自變量x1，x2，…，xn取值范圍即最佳試驗(yàn)條件的優(yōu)化法。該方法具有試驗(yàn)次數(shù)少，試驗(yàn)精度高，能夠采用非線性預(yù)測模型擬合，在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)以提高精度，使預(yù)測值更接近真實(shí)值等特點(diǎn)，在藥學(xué)應(yīng)用上成效顯著［3-6］。然客觀來說，該方法不適宜用于非連續(xù)型變量的考察，所以在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)應(yīng)盡可能選用連續(xù)變量，而非連續(xù)性變量宜用其他方法先考察。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀，Empower色譜工作站，2996二極管陣列檢測器；梅特勒電子天平。

1.2 試藥 薯蕷皂苷元對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所提供），甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純。鐵筷子藥材采自陜西秦嶺山區(qū)。

2 方法與結(jié)果

2.1 陜產(chǎn)鐵筷子皂苷元的含量測定［7］

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用Waters 2695高效液相色譜儀，2996PDA檢測器，色譜柱C18ODS柱；流速：1.0 mLmin；柱溫：25℃；檢測波長：203 nm；流動(dòng)相：（乙腈：水＝85∶15）。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 m L含0.6 mg溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取20份鐵筷子藥材，每份20 g，按照表2的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行回流提取，提取液過濾，濾液定容，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密移取薯蕷皂苷元對(duì)照品5μL、10μL、20μL、25μL、30μL注入高效液相色譜儀中，在上述的色譜條件下進(jìn)行分析，以峰面積A為縱坐標(biāo)，薯蕷皂苷元含量C（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程為：A＝201 120C-75 214，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 7。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μL，并依據(jù)上述色譜條件，記錄峰面積，結(jié)果RSD為1.24%（n＝6）。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)照品溶液在1 h、2 h、4 h、8 h、24 h分別取10μL，記錄峰面積，結(jié)果RSD為1.46%。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品適量，共6份，照“2.1.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別精密取10 μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下測得樣品，RSD為3.52%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 采取加樣回收法，取一定量已知含量的樣品6份，分別精密加入薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，照“2.1.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定含量，計(jì)算回收率為99.78%，RSD為2.96%。

2.1.9 樣品的測定 精密吸取制備好的供試品溶液，依上述色譜條件測定，計(jì)算即得。

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選方法［8-16］

2.2.1 實(shí)驗(yàn)因素的確定 鐵筷子皂苷是黃酮屬于中等極性物質(zhì)，可選擇乙醇作為提取劑，結(jié)合藥學(xué)領(lǐng)域的提取特點(diǎn)和產(chǎn)業(yè)化方法，因此本實(shí)驗(yàn)的考察因素可以是乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)和溶媒用量，其中由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)上的回歸處理，故本實(shí)驗(yàn)中對(duì)提取次數(shù)結(jié)合生產(chǎn)的成本、提取率及其預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，暫定為3次。

2.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)CCD原理，選取乙醇濃度，提取時(shí)間，溶媒用量對(duì)薯蕷皂苷元含量影響顯著的3個(gè)因素，采用3因素5水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分別見表1、表2。

表1 因素水平表

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果

2.2.3 模擬方程的建立與方差分析 應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合，得到乙醇濃度（X1）、溶媒用量（X2）、提取時(shí)間（X3）與薯蕷皂苷元之間的二項(xiàng)式回歸方程和多元線性回歸方程，分別如下：Y＝0.061+5.592× 10-3X1+2.276×10-3X2+1.386×10-3X3+5.250× 10-4X1X2+1.350×10-3X1X3-5.750×10-4X2X3-4.063×10-3X21-4.682×10-3X22-1.305×10-3X23。對(duì)該二項(xiàng)式模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，其中R＝0.920 6，該模型擬合度較好并具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.001，充分證明響應(yīng)面法優(yōu)化陜產(chǎn)鐵筷子皂苷提取工藝是可行的。

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果

圖1 乙醇濃度和溶媒用量對(duì)薯蕷皂苷元含量的影響

圖2 乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)薯蕷皂苷元含量的影響

圖3 溶媒用量和提取時(shí)間對(duì)薯蕷皂苷元含量的影響

2.2.4 工藝參數(shù)優(yōu)化與預(yù)測 把因變量與其中任2個(gè)因素?cái)M合為三維曲面圖，以擬合目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，繪制因變量曲面和等高線圖（見圖1-圖3），在圖上選取薯蕷皂苷元得率最佳工藝參數(shù)：乙醇濃度67.84%，提取時(shí)間117.63 min，溶媒用量倍數(shù)6.48倍，考慮到工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際情況，故把提取鐵筷子中薯蕷皂苷元的優(yōu)化工藝暫定為乙醇濃度為70%，提取時(shí)間為120 min，溶媒比為6.5倍。由簡化后的二項(xiàng)式模型進(jìn)行預(yù)測分析，薯蕷皂苷元含量最大值為0.064 4 gg，根據(jù)最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際皂苷元提取量平均值為0.065 8 gg（n＝3），實(shí)際值比預(yù)測值高2.13%。

3 討論

本試驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)鐵筷子中的薯蕷皂苷提取方法進(jìn)行了研究，最終預(yù)測最佳提取工藝條件為：乙醇濃度70%，提取3次，每次提取時(shí)間為2 h，溶媒比為6.5倍，二項(xiàng)式擬合判定系數(shù)較高（R＝0.920 6），在此工藝條件下陜產(chǎn)鐵筷子提取物中薯蕷皂苷元的含量為0.065 8 gg。

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（2014-02-07收稿 責(zé)任編輯：徐穎）

Optimization of Extraction Technology for Helleborus Thibetanus Franch of Shaanxiby Central Composite Design-Response Surface Method

Wang Yueru1，Xie Wei2，Zhang Jian2，Xi Pengzhou2
（1 Shaanxi Institute of International Trade and Commerce，Xianyang 702046，China；2 Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co．Ltd．，Xi'an 710075，China）

Objective：To optimize the extraction technology of total dioscin from Helleborus thibetanus Franch of Shaanxi by central composite design response surface method.Methods：Ethanol was used as the extraction solvent，and the parameters of ex-traction technology of total dioscin from Helleborus thibetanus Franch were optimized by 3 factors and 5 levels.Independent variables were ethanol concentration，ethanol multiples and extraction time；dependent variable was the dioscin content.Results：The optimal extraction technology was realized by the following conditions：ethanol concentration was 70%，ethanol was multiplied with 6.5 times，and extraction time was 2 hours.The maximal yield of total dioscin reached to 0.065 8 gg.Regression coefficient of the binomial fittingcomplex model was 0.8 475.Conclusion：The technology can be used as the extraction process of total dioscin from Helleborus thibetanus Franch of Shaanxi.

Helleborus thibetanus Franch；Central composite design；Response surface methodology；Extraction process

R284.2

A

10.3969j.issn.1673-7202.2014.12.028