溫敏型辛夷納米凝膠的體內(nèi)外釋藥規(guī)律研究

張 欣 吳 敏 閻秀菊 馬 博

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院中醫(yī)科，上海，200092）

溫敏型辛夷納米凝膠的體內(nèi)外釋藥規(guī)律研究

張 欣 吳 敏 閻秀菊 馬 博

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院中醫(yī)科，上海，200092）

目的：研究溫敏型辛夷納米凝膠在體內(nèi)和體外的釋藥規(guī)律。方法：體內(nèi)釋藥規(guī)律研究采用在體大鼠鼻腔灌洗法，體外釋藥規(guī)律研究采用Franz擴散池法，利用HPLC法進行測定。結(jié)果：體外釋藥實驗表明溫敏型辛夷納米凝膠12 h累積釋放率為14%；采用動力學(xué)模型處理表明，溫敏型辛夷納米凝膠體內(nèi)釋藥模式符合一級動力學(xué)過程，具有緩釋效應(yīng)。結(jié)論：溫敏型辛夷納米凝膠具備良好的緩釋性能。

辛夷揮發(fā)油；納米；溫敏凝膠；體外釋藥；體內(nèi)釋藥

辛夷揮發(fā)油是辛夷的有效成分之一，具有良好的抗炎、抗過敏等作用，藥理活性廣泛［1］。但由于其制劑粗糙，穩(wěn)定性低，影響了辛夷的療效發(fā)揮，限制了辛夷的臨床應(yīng)用［2］。

前期研究［3］采用納米技術(shù)，已經(jīng)制備出辛夷揮發(fā)油納米脂質(zhì)體，并證實其具有抗炎、抗過敏等作用，療效優(yōu)于辛夷揮發(fā)油，其納米尺度效應(yīng)可顯著提升辛夷揮發(fā)油的藥效。并在原有研究的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地采用冷凍干燥技術(shù)，將辛夷揮發(fā)油納米脂質(zhì)體制成凍干粉，以提高藥物的穩(wěn)定性，便于脂質(zhì)體大量制備和長期保存。并且將溫敏型高分子材料洛沙姆407（F127）和泊洛沙姆188（P188）引入鼻腔給藥系統(tǒng)，制成溫敏型復(fù)溶液，通過利用復(fù)溶液復(fù)溶辛夷納米凍干粉，從而制備得辛夷納米脂質(zhì)體凝膠。該凝膠不僅具有一般鼻用制劑的優(yōu)點，還可以明顯延長藥物在鼻腔的滯留時間，提高藥物療效。本實驗旨在通過體內(nèi)外不同的釋藥方法，研究溫敏型辛夷納米凝膠的釋藥模式，證實其緩釋性能，為納米中藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠，雄性，體重為200～250 g。由新華醫(yī)院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2002-0010；使用許可證號：SYXK（滬）2003 -0031。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 試劑和儀器 溫敏型辛夷納米凝膠，自制；洛沙姆407（P407F127）泊洛沙姆188（P188）：BASF公司；Agilent Technologies 1200系列高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Inertsil ODS-3柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）：Dikma公司；半透膜（截留分子量7000 μ），上海源聚生物科技有限公司；Franz擴散池，上海黃河儀器儀表廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外釋藥模式的考察 本實驗采用Franz擴散池法。在兩池間固定半透膜（截留分子量為7000μ），溫敏液約1 mL，使其均勻分布在半透膜表面，放入33℃烘箱中5 min使其形成凝膠。將擴散池放入33℃水浴中，往接收池中加入己預(yù)熱至33℃的無水乙醇5 m L作為接收液，接收池中置一攪拌子以300 rmin的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動，分別于5 min、10 min、20 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h分別取樣1 mL，而后迅速補加等量預(yù)熱的無水乙醇。樣品必要時適當(dāng)稀釋使?jié)舛仍跇?biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，采用HPLC法測定。

1.3.2 在體鼻腔吸收規(guī)律的考察

1）實驗動物模型及裝置：選擇體重在250 g左右的健康雄性大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉2.5 mLkg。麻醉后切開頸部，暴露氣管和食管，向氣管中插入聚乙烯套管，用相同直徑的鼻腔套管由食管插向鼻腔后部，將口、鼻腔相連的鼻腭進行封閉，防止藥液從口腔流出。用橡膠管與插入大鼠鼻腔后部的套管相連，管子的另一端與清洗液（生理鹽水）接觸，將盛有生理鹽水的容器置于約4℃的冷水浴中。本實驗中采用單側(cè)鼻腔給藥的方式，另一鼻孔用502膠封閉。給藥后，藥物在鼻腔中滯留一定時間，用電子蠕動泵使生理鹽水從鼻孔中將藥液沖出，收集清洗液，用HPLC法測定其中含藥量。

2）在體鼻腔清洗液用量的考察：為了考察洗凈鼻腔內(nèi)殘留藥物需用的清洗液量，向一側(cè)鼻孔注入溫敏溶液20μL，待形成凝膠后，立刻由鼻腔套管以2 m Lmin的流速灌注生理鹽水。經(jīng)多次試驗表明，至少需要5 mL的清洗液，才可達(dá)到93%以上的回收率。所以鼻腔內(nèi)殘留藥物需用的清洗液量為5 mL以上，本實驗選擇清洗液體積為6 mL。

3）鼻腔清洗液的收集和測定：單側(cè)鼻腔給予溫敏液10μL，待凝膠形成后，用6 mL清洗液以2 mLmin流速沖洗大鼠鼻腔，取滯留時間為10 min、15 min、20 min、30 min、60 min、120 min的清洗液，補加生理鹽水至6 m L。采用HPLC法測定，以外標(biāo)法計算含量，即為溫敏凝膠的殘余量，吸收藥量＝給藥量-殘留藥量。

1.3.3 高效液相色譜方法的建立

1）色譜條件的選擇：用氣相色譜-質(zhì)譜法對辛夷揮發(fā)油化學(xué)成分進行分析，共鑒定出30個成分，占揮發(fā)油成分的81%以上，主要包括桉油精、樟腦、α-蒎烯等。本實驗選用樟腦作為對照品，建立HPLC法測定藥物含量。

圖1 樟腦的紫外圖譜

2）檢測波長的選擇：根據(jù)《中華人民共和國藥典2005年版（二部）》，紫外-可見分光光度法鑒別樟腦，在230～350 nm的波長范圍內(nèi)測定吸光度，在289 nm有最大吸收。配制濃度為0.904 mgmL的樟腦溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描。結(jié)果見圖1。經(jīng)多次掃描結(jié)果表明，樟腦的最大吸收波長為（202±1）nm。雖然202 nm為末端吸收，但靈敏度較高，其吸光度約為289 nm的8倍左右，所以波長選擇203 nm。色譜條件如下：色譜柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相：乙腈∶水（80∶20），檢測波長：203 nm，流速：1.0 mLmin，柱溫：室溫，進樣量：5 μL。

在上述色譜條件下分別測定樟腦、鼻腔分泌物溶液及含有溫敏型辛夷納米凝膠的鼻腔分泌物溶液的色譜圖，見圖2-圖4。圖2為樟腦溶液色譜圖，圖4為含有溫敏型辛夷納米凝膠的鼻腔分泌物溶液的色譜圖，由圖可見，鼻腔分泌物對溫敏型辛夷納米凝膠的測定沒有干擾。

圖2 樟腦色譜圖

圖3 鼻腔分泌物色譜圖

圖4 含藥的鼻腔分泌物溶液的色譜圖

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取樟腦對照品9.04 mg置于10 mL量瓶中，加入無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4 mL，分別置于2 m L容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻配成不同濃度的溶液。按照HPLC法進行測定，以樟腦峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y＝431.927x -9.99，R2＝0.09998。結(jié)果表明在濃度0.09～0.63 mgmL范圍內(nèi)，峰面積與濃度具有較好的線性關(guān)系，結(jié)果見圖5。

圖5 樟腦的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溫敏型辛夷納米凝膠的體外釋藥考察 采用Franz擴散池法研究溫敏型辛夷納米凝膠的體外釋放情況。計算累積釋放量，見表1。

表1 溫敏型辛夷納米凝膠體外釋藥結(jié)果（mgcm2，n＝3）

由累積釋放率對時間作圖即可得體外釋放曲線，進一步擬合找出釋放規(guī)律。從試驗結(jié)果來看，溫敏型辛夷納米凝膠釋藥模式具有分段性，前30 min符合Higuchi方程，以擴散過程為主，可能的原因是這段時間少量游離的辛夷油率先擴散到外面溶液中。30 min后呈現(xiàn)零級釋藥模式，說明此時的凝膠可以連續(xù)穩(wěn)態(tài)釋藥，辛夷油通過凝膠的控釋作用釋放，成為整個辛夷油釋藥的限速步驟。溫敏型辛夷納米凝膠12 h累積釋放率為14%。見圖6。

圖6 溫敏型辛夷納米凝膠的釋藥曲線

將溫敏型辛夷納米凝膠在4℃條件下密封儲存，平均分成4份，分別在不同時間考察其釋藥模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)避光、密封于4度冰箱條件下儲存1周、2周、1個月的樣品和新制備的樣品相比釋藥模式無明顯變化。見表2。

表2 樣品體外釋藥動力學(xué)參數(shù)

2.2 在體鼻腔吸收規(guī)律研究 采用動力學(xué)模型處理，結(jié)果表明溫敏型辛夷納米凝膠的吸收符合一級動力學(xué)過程，表明其具有緩釋效應(yīng)。見表3和圖7。

表3 平均吸收藥量（μg，n＝3）

圖7 溫敏型辛夷納米凝膠鼻腔吸收曲線

3 討論

變應(yīng)性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）是由免疫球蛋白（IgE）介導(dǎo)通過釋放組織胺或其他化學(xué)活性物質(zhì)誘發(fā)的鼻黏膜I型變態(tài)反應(yīng)［4］。目前缺少有效的治療藥物，特別是兒童變應(yīng)性鼻炎患者，西醫(yī)治療的一線藥物是鼻用糖皮質(zhì)激素和抗組胺藥物，雖然鼻用激素在治療AR中的療效確切，但并不能治愈AR，而且停藥后有反跳現(xiàn)象，特別是長期讓患兒使用其累積的不良反應(yīng)不可忽視［5］。中醫(yī)藥治療變應(yīng)性鼻炎具有療效顯著、不良反應(yīng)較少的特點。辛夷是治療變應(yīng)性鼻炎的常用藥物，具有祛風(fēng)通竅的作用，其有效成分為揮發(fā)油，具有廣泛的抗過敏藥理活性［6］。

納米脂質(zhì)體是以磷脂為主要材料制成的具有生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子囊［7］，是一種新型的鼻腔給藥載體。前期研究已經(jīng)成功制備出辛夷揮發(fā)油納米脂質(zhì)體，既保持了辛夷的藥理活性，又具備普通揮發(fā)油制劑沒有的優(yōu)勢［8］。辛夷納米脂質(zhì)體生物相溶性好，脂質(zhì)雙分子層與生物膜有較大的相似性與組織相溶性，易于被組織吸收，可減少對鼻黏膜的毒性和刺激［9］；其次，納米脂質(zhì)體保護藥物不被鼻腔黏液中的酶降解，并且持續(xù)釋放包封藥物，達(dá)到長效緩釋的作用［10］。

但是液態(tài)脂質(zhì)體的貯存穩(wěn)定性較差。在貯存過程中極易發(fā)生團聚、融合及藥物滲漏［11］，且主要膜材磷脂易氧化、水解，難以滿足藥物制劑穩(wěn)定性的要求，同時由于溫度、光線等影響產(chǎn)生乳析、凝聚、融合、粒徑變大等現(xiàn)象，這些變化都對脂質(zhì)體的應(yīng)用產(chǎn)生負(fù)面的效應(yīng)，使應(yīng)用受到了很大限制。為此，必須采用適當(dāng)?shù)姆椒▉硖幚硪簯B(tài)脂質(zhì)體來提高其貯存穩(wěn)定性。

低溫冷凍干燥技術(shù)［12］是提高蛋白、藥物等生物活性物質(zhì)和聚合物藥物等體系貯存穩(wěn)定性的有效手段。制成的凍干脂質(zhì)體可顯著降低磷脂和藥物的水解和氧化速度，同時，凍干保護劑也保持了脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的完整性，克服脂質(zhì)體聚集、融合及藥物滲漏等不穩(wěn)定因素［13］，顯著提高貯存穩(wěn)定性。目前，該法已成為改善脂質(zhì)體制劑長期穩(wěn)定性的方法之一。

臨床治療中亦發(fā)現(xiàn)，常用的滴鼻液由于鼻纖毛的清除功能，藥物在鼻黏膜上停留時間短，僅有15～30 min［14］。因此在一定程度上影響了藥物的吸收和療效，且鼻腔容積較小，給藥劑量有一定限制［15］。凝膠劑用于鼻腔給藥，具有一定的緩釋作用，能使藥物緩慢持續(xù)地被釋放，增加了藥物與鼻黏膜的接觸時間［16］。但是由于凝膠劑型質(zhì)地黏稠，不易使凝膠藥物進入鼻腔［17］。如能將藥物的易于給藥性和凝膠劑的緩釋性相結(jié)合，將會大大提升藥物的生物利用度。因此我們創(chuàng)新性地制備溫敏型辛夷納米凝膠，通過溫敏凝膠的控緩釋系統(tǒng)，進一步提高辛夷揮發(fā)油的生物利用度。

本實驗中通過體外釋藥實驗研究溫敏型辛夷納米凝膠的控緩釋性。研究結(jié)果顯示12 h累積釋藥率為14%，表明該溫敏制劑具有明顯的控緩釋作用。采用大鼠在體鼻腔滯留法考察溫敏型辛夷納米凝膠的鼻腔吸收規(guī)律，結(jié)果顯示符合一級動力學(xué)方程，表明該制劑具有緩釋效應(yīng)。

揮發(fā)油類中藥占中藥類的35%左右［18］，但因其易揮發(fā)、不穩(wěn)定、刺激性大等缺點限制了臨床的應(yīng)用。我們應(yīng)用現(xiàn)代納米技術(shù)制備納米中藥，使其便于應(yīng)用、貯存、運輸，并且經(jīng)過研究證明納米尺度效應(yīng)可顯著提高藥物療效。但是，納米技術(shù)既是現(xiàn)在臨床研究的熱點也是難點，我們雖然已經(jīng)取得了一定的成果，但本課題缺少臨床藥效學(xué)和毒理研究，應(yīng)在后續(xù)研究中進一步展開，以便于應(yīng)用臨床。

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（2014-03-17收稿 責(zé)任編輯：曹柏）

Study on the Drug Release of Temperature-sensitive Nanogels of Magnolia in Vitro and in Vivo

Zhang Xin，Wu Min，Yan Xiuju，Ma Bo
（Department of Traditional Chinese Medicine，Xinhua Hospital affiliated to School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai200092，China）

Objective：To study the drug release of temperature-sensitive nanogels of Magnolia in vitro and in vivo.Methods：We investigated the process of in vitro drug release of temperature-sensitive nanogel of Magnolia with Franz diffusion cell.The regulation of nasal absorption of temperature-sensitive nanogel of Magnolia was investigated by the rat in situ nasal deposit method.The method of HPLC was conducted.Results：The study on drug release in vitro showed that the cumulative release rate in12 hours was 14%.The treatment of dynamic model showedthat the absorption process of this preparation fitted the first-order dynamics process，with slow-release effect.Conclusion：Temperature-sensitive nanogels of Magnolia has satisfactory slow-release effect.

Magnolia volatile oil，Nano；Temperature-sensitive gel；In vitro release；In vivo release

R-332；R283.6

A

10.3969j.issn.1673-7202.2014.12.027

上海交通大學(xué)醫(yī)工結(jié)合專項基金（編號：YG2010MS14）

吳敏，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療過敏性疾病的研究，E-mail：seyyer＠126.com