胰高血糖素樣肽-1在中醫(yī)振腹療法治療2型糖尿病中的機制探討

范德宇 姜默琳 冒慧敏 季 然 李祎銘 指導老師：林彩霞 陳幼楠

（北京中醫(yī)藥大學，北京，100029）

胰高血糖素樣肽-1在中醫(yī)振腹療法治療2型糖尿病中的機制探討

范德宇 姜默琳 冒慧敏 季 然 李祎銘 指導老師：林彩霞 陳幼楠

（北京中醫(yī)藥大學，北京，100029）

目的：探究中醫(yī)振腹療法在治療2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）中對胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1）及大鼠糖代謝的影響及機制。方法：采用長期高糖高脂飼料飼養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素（STZ，30 mg·kg-1，腹腔注射）誘導2型糖尿病大鼠模型，動物隨機分為空白對照組、模型組、西藥組、振腹組、西藥加振腹組。結果：與模型組比較，振腹組體重變化量明顯減?。≒＜0.05），西藥加振腹組體重變化量與西藥組比較明顯減?。≒＜0.05）。治療后振腹組大鼠血糖值較模型組顯著降低（P＜0.05）。振腹組和西藥加振腹組GLP-1含量較模型組顯著升高（P＜0.05），西藥加振腹組GLP-1含量較西藥組升高（P＜0.05）。各組病理結果顯示：西藥加振腹組的大鼠胰腺破壞的程度最低，其次是振腹組、西藥組、模型組。結論：振腹療法可以降低血糖，改善糖尿病癥狀，減輕或減緩胰島細胞破壞，其降糖作用可能與GLP-1途徑有關。

振腹療法；2型糖尿病；胰高血糖素樣肽-1；空腹血糖；胰島β細胞及小腸形態(tài)

振腹療法是傳統(tǒng)中醫(yī)推拿手法中振法衍生的產物，是由北京中醫(yī)藥大學臧福科教授，在上個世紀80年代提出。大量臨床報道指出，振腹療法治療糖尿病療效顯著，尤以2型糖尿病為佳［1-4］。但關于振腹療法治療糖尿病的機制，尚未見相關報道。糖尿病是危害人類健康的常見疾病，現(xiàn)代醫(yī)學對于糖尿病的治療主要選用胰島素及口服降糖藥物兩大類。近年來，GLP-1類似物成為研究熱點。其由腸道L細胞分泌，主要通過葡萄糖依賴性促進胰島素分泌、促進胰島細胞增生、抑制胰升糖素分泌及抑制食欲等途徑降低血糖。振腹療法作用于腹部，亦直接作用于腸道，大量臨床報道表明振腹療法具有調節(jié)內分泌功能的作用［3］。因此，我們設想振腹療法可通過促進腸道分泌GLP-1來治療2型糖尿病，即振腹療法-腸-胰島軸的建立。本實驗擬在基于GLP-1，驗證中醫(yī)振腹療法對2型糖尿病的防治作用，并力爭為2型糖尿病的防治帶來新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

1.1.1 實驗動物 清潔級近交系雄性Wistar大鼠30只，8周齡，體重（215±5）g。購于北京市維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）-2006-0009。

1.1.2 動物飼料 高糖高脂飼料［5］由基礎鼠飼料加蔗糖、煉豬油和蛋黃按比搭配制作高脂高糖飼料：其比例為豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%、基礎飼料59%。普通飼料成分：小麥、玉米、進口魚粉、氨基酸、維生素、礦物元素添加劑等。普通飼料均由北京科澳協(xié)力公司提供。

1.1.3 治療2型糖尿病藥物 鹽酸二甲雙胍緩釋片（格華止，中美上海施貴寶制藥有限公司）

1.1.4 點穴按摩器 型號HS302MINI，頻率400 Hz，最大振幅約0.5 cm［6］。（韓尚科技有限公司制作）

1.1.5 試劑及儀器 試劑及儀器：GLP-1大鼠胰高血糖素樣肽試劑盒（北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學技術有限公司提供）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）。羅氏快速血糖測定儀及配套血糖試紙，酶標儀：芬蘭（Labsystems Multiskan，MS），儀器型號：352型；洗板機：芬蘭（Thermo Labsystems），儀器型號：AC8；離心機：微量高速離心機（國產），儀器型號：TG16W；培養(yǎng)箱：隔水式恒溫培養(yǎng)箱（國產），儀器型號：GNP-9080型；尼康正置生物顯微鏡（Nikon eclipse 50i，日本）。

1.1.6 實驗器械 手術常用無菌器械、電子天平、離心機、移液槍（均由北京中醫(yī)藥大學西區(qū)實驗室提供）

1.2 分組與造模 適應性喂養(yǎng)1周后血糖正常者（3～7.5 mmolL）［7］納入研究對象，按體重隨機分出對照組6只、造模組24只。采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)加小劑量STZ方法造模［8］。模型成功標準：空腹血糖（FBG）≥16.7 mmolL作為大鼠2型糖尿病成模標準［9］。排除標準：適應性飼養(yǎng)時隨機血糖不在正常范圍內（≥7.5 mmolL，≤3 mmolL）［10］；不符合納入標準者。造模組分為模型組、西藥組、振腹組、西藥加振腹組，每組各6只。

1.3 干預方法 3 d適應性固定結束后，將振腹組大鼠固定于固定器中，參照全國針灸學會實驗針灸研究會制定的“實驗動物針灸穴位圖譜-大鼠”點穴按摩器頭部貼放在大鼠腹部以覆蓋神闕穴、天樞穴、中脘穴、關元穴［11］，實施振法，振動頻率為400次min，振幅為0.5 cm，每次20 min，1次d，1個療程7 d，連續(xù)2個療程?？瞻讓φ战M：不采用任何干預方法；模型組：不采用干預措施；西藥組：采用鹽酸二甲雙胍緩釋片按大鼠體重標準劑量灌胃［12-13］，1次d，治療2周；振腹組：采用點穴按摩器振腹每次20 min，1次d，1個療程7 d，治療2周［14］；西藥加振腹組：采用西藥加振腹聯(lián)合應用，治法同上，治療2周?？偣?2周。

1.4 指標的測定

1.4.1 行為學指標 觀察各組大鼠毛發(fā)生長情況及排泄情況，并在實驗開始后每隔7 d測量所有大鼠體重并做記錄。

1.4.2 生化指標 空腹血糖的檢測：測量前禁食6 h，用羅氏快速血糖儀檢測。檢測時間點如下：實驗開始前隨機測量1次，篩選合格動物；注射STZ前測量血糖1次；注射STZ后2周測量1次，篩選模型；2周治療完畢，處死前，測量1次，評價治療效果。

1.4.3 GLP-1的測定 第1 d禁食不禁水12 h，剪尾取血1 mL，樣本靜置30 min后3000 rmin離心15 min，分離血清以檢測GLP-1。采用酶聯(lián)免疫法（ELISA試劑盒）測定GLP-l。

1.4.4 胰腺及小腸取材 分離胰腺及小腸空腸段組織標本數(shù)塊，置于10%中性甲醛固定，后進行HE染色，切片。光鏡下觀測胰島、胰島β細胞、小腸絨毛的形態(tài)結構。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件包行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示。

2 結果

2.1 各組大鼠體重比較

2.1.1 各組大鼠體重動態(tài)變化 治療期內，從體重的動態(tài)變化來看，模型組呈下降趨勢，西藥組的下降趨勢小于模型組。隨著治療的進行，振腹組及西藥加振腹組總體呈上升趨勢，且西藥加振腹組的上升趨勢較單純振腹組更明顯（見圖1）。

圖1 各組大鼠體重動態(tài)變化

2.1.2 大鼠體重動態(tài)變化的組間比較 治療期間，模型組與西藥組、振腹組、西藥加振腹組的體重在各個時間點上均無統(tǒng)計學意義；治療前后，模型組與西藥組的體重變化量比較，無統(tǒng)計學意義。模型組與振腹組及西藥加振腹組的體重變化量比較明顯增加，有統(tǒng)計學意義（P＝0.000）。西藥組與西藥加振腹組體重變化量比較明顯增加，有統(tǒng)計學意義（P＝0.008）（見表1）。

表1 各組大鼠體重比較（g，±s）

表1 各組大鼠體重比較（g，±s）

注：與西藥組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

±3.34模型組5 385.00±14.69 369.50±14.49 353.54±11.91-31.46±9.13西藥組4 374.22±10.91 360.22±13.18 358.43±8.26-15.80±6.10振腹組5 373.26±3.47 368.10±6.82 373.24±8.62-0.20±6.00△西藥加振腹組4 370.03±8.03 368.95±7.12 378.50±9.21 8.48±7.32△體重變化量對照組5 505.32±7.36 524.74±7.81 536.66±7.69 31.34組別例數(shù)治療前治療1周治療2周*

2.2 各組大鼠空腹血糖（FBG）比較 治療前與對照組FBG比較，模型組、西藥組、振腹組、西藥加振腹組明顯升高（P＜0.05）。治療第1周，與對照組FBG比較，模型組、西藥組、振腹組及西藥加振腹組明顯升高（P＜0.05）。模型組與西藥加振腹組FBG比較明顯升高（P＜0.05）。治療第2周，與對照組FBG比較，模型組、西藥組、振腹組、西藥加振腹組明顯升高（P＜0.05）；模型組FBG與西藥組、振腹組、西藥加振腹組比較顯著升高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表2）。

表2 各組大鼠血糖比較（mmolL，±s）

表2 各組大鼠血糖比較（mmolL，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，與模型組比較，△P＜0.05。

5 5.32±0.22 5.78±0.40 6.64±0.48模型組5 29.14±2.68*32.46±0.84*33.18±0.56*西藥組4 33.28±1.45*30.93±1.75*28.70±1.59*△振腹組5 32.42±0.88*31.48±1.19*29.92±1.19*△西藥加振腹組4 29.05±2.97*27.40±2.04*△27.40±2.04 FBG對照組組別例數(shù)治療前FBG治療1周FBG治療2周*△

2.3 各組大鼠GLP-1比較 治療后振腹組及西藥加振腹組GLP-1值與模型組比較顯著增高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；西藥加振腹組與西藥組GLP-1值比較顯著升高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（見表3）。

表3 各組大鼠GLP-1比較（ngmL，±s）

表3 各組大鼠GLP-1比較（ngmL，±s）

88.79±1.74模型組5 95.18±0.62西藥組4 84.99±1.84△△振腹組5 102.00±1.63△△西藥加振腹組4 102.15±1.27 GLP-1對照組組別例數(shù)5△△**

2.4 各組胰島及胰島細胞的形態(tài)學觀察及比較 顯微鏡下觀察到空白對照組大鼠胰島形態(tài)規(guī)則，結構完整，胰島細胞整體分布均勻，細胞間界限清楚。未見胞漿腫脹、纖維組織增生（見圖2）。模型組：顯微鏡下觀察到胰島形態(tài)差異較大，部分胰島已有增生肥大，形態(tài)多呈不規(guī)則形，細胞核聚集。胰島細胞分布不均勻，胞漿肥大較為明顯，細胞間界限模糊，部分細胞碎裂溶解（見圖3）。西藥組：與模型組類似，細胞核聚集，胰島細胞有部分肥大（見圖4）。振腹組：邊界較模型組清晰，細胞核聚集較少。未見胞漿腫脹、纖維組織增生（見圖5）。振腹加西藥組：邊界較模型組清晰，較模型組形態(tài)規(guī)則，細胞核聚集少（見圖6）。

圖2 光鏡下空白對照組胰島細胞觀測圖

圖3 光鏡下模型組胰島細胞觀測圖

圖4 光鏡下西藥組胰島細胞觀測圖

圖5 光鏡下西藥組胰島細胞觀測圖

圖6 光鏡下振腹加西藥組胰島細胞觀測圖

2.5 各組小腸絨毛的形態(tài)學觀察及比較 顯微鏡下觀察到各組大鼠小腸空腸段形態(tài)規(guī)則，結構完整，小腸絨毛細胞生長良好，細胞間界限清楚。未見腫瘤，炎性疾病等，符合正常小腸形態(tài)，各組間無顯著差異。

3 討論

振腹療法是傳統(tǒng)中醫(yī)推拿手法中振法衍生的產物，大量臨床報道指出，振腹療法治療糖尿病效果顯著。但關于振腹療法治療糖尿病的機制，尚未見相關報道。臨床報道振腹療法具有調節(jié)內分泌功能的作用。因此，我們設想振腹療法是通過促進腸道分泌GLP-1從而治療2型糖尿病。

實驗表明，按造模動物體重的動態(tài)變化來看，模型組呈下降趨勢，西藥組的下降趨勢小于模型組。隨著治療的進行，振腹組及西藥加振腹組體重總體呈上升趨勢。這表明，經振腹干預后，有緩解體重下降趨勢，減輕T2DM癥狀。各組大鼠在治療1周后，西藥組、振腹組雖較1周前FBG略有下降，但無統(tǒng)計學意義，西藥加振腹組TBG較1周前有明顯下降，有統(tǒng)計學意義。各組大鼠在治療2周后，西藥組、振腹組、西藥加振腹組TBG較2周前有明顯下降，與模型組比較，有統(tǒng)計學意義。西藥組、振腹組與西藥加振腹組間比較無統(tǒng)計學意義。這表明振腹療法可降低血糖，調整糖代謝，其結果與西藥有等同的關系。各組大鼠GLP-1比較，治療后振腹組及西藥加振腹組GLP-1值與模型組比較顯著增高，具有統(tǒng)計學意義，西藥加振腹組與西藥組GLP-1值比較顯著升高，具有統(tǒng)計學意義。說明振腹療法的降糖作用可能與GLP-1途徑有關，其具體機制有待更進一步研究。從各組大鼠胰島β細胞病理切片上看，西藥加振腹組的胰腺被破壞的程度最低，其次是振腹組，西藥組，模型組，這表明或許振腹療法有減輕或減緩胰島細胞破壞的作用。從各種小腸絨毛細胞來看，符合正常形態(tài)，各組間無顯著差異。

綜上所述，中醫(yī)振腹療法治療高糖高脂飼料加小劑量STZ的T2DM模型大鼠是有效的，可緩解體重下降趨勢，增加體重，減輕T2DM癥狀，調整糖代謝，減緩胰島細胞破壞。實驗表明，振腹療法與西藥聯(lián)合應用作用明顯優(yōu)于單純的西藥降糖作用。本實驗初步驗證了振腹療法可通過振腹療法-腸-胰島軸從而降糖的結論，其作用機理與GLP-1途徑有關，中醫(yī)振腹療法作為非藥物療法展現(xiàn)出了廣大而實用的臨床應用前景。

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［14］邱萬光.振腹療法研究［J］.中醫(yī)臨床研究，2010，20（1）：35.

（2013-11-18收稿 責任編輯：曹柏）

Study on Mechanism of TCM Abdominal Vibration Therapy Curing Type 2 Diabetes Mellitus via GLP-1 Pathway

Fan Deyu，Jiang Molin，Mao Huimin，Ji Ran，Li Yiming，Instructor：Lin Caixia，Chen Younan
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Objective：The study was to explore the effect of TCM abdominal vibration treatment on glucagon-like peptide-1（GLP-1）and rat's glucose metabolism.Methods：To induced animal models of type 2 diabetes with Long-term high glucose and lipid diet and a small dose of streptozotocin（STZ，30mg·kg-1，ip）.Rats were random ly divided into control group，model group，western medicine group，abdominal vibration group，western medicine plus abdominal vibration group.Results：After treatment，the weight of abdominal vibration group was significantly reduced compared to T2DM model group.Weight reduction was more significant in western medicine plus abdominal vibration group than in western medicine group（P＜0.05）.GLP-1 increased significantly in abdominal vibration group，western medicine group，western plus abdominal vibration group（P＜0.05）.The pathological slice of Islet beta cell showed that western medicine plus abdominal vibration group was least damaged，followed by abdominal vibration group，western medicine group and model group.Conclusion：Abdominal vibration therapy can reduce serum glucose，relieve diabetes symptoms and cell damage via GLP-1 pathway.

Abdominal vibration therapy；Type 2 diabetes mellitus（T2DM）；Glucagon-like peptide-1（GLP-1）；Fasting plasma glucose；Islet beta celland intestinal morphology

R332；R259

A

10.3969j.issn.1673-7202.2014.12.021

北京市共建項目課題（編號：BJ1103）

范德宇，Tel：（010）84612290

林彩霞（1960—），女，碩士，教授，碩士生導師，研究方向：針灸推拿作用機理，E-mail：doctorlincaixia＠sina.com；陳幼楠（1980—），女，博士，講師，研究方向：推拿治療內科病的機理，E-mail：chenyounan2010＠163.com