大力參急性毒性與遺傳毒性試驗(yàn)研究※

楊曉峰陳文學(xué)陳志福楊 明*

（1通化興華藥業(yè)有限責(zé)任公司,通化134008;2吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院新藥研究開發(fā)中心,長(zhǎng)春130021）

大力參急性毒性與遺傳毒性試驗(yàn)研究※

楊曉峰1陳文學(xué)2陳志福1楊 明2*

（1通化興華藥業(yè)有限責(zé)任公司,通化134008;2吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院新藥研究開發(fā)中心,長(zhǎng)春130021）

目的 了解大力參急性毒性及遺傳毒性,為大力參的食用安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 采用小鼠及大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn); Ames試驗(yàn)（每皿分別加入8、40、200、1000、4000μg大力參）、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)與小鼠精子畸形試驗(yàn)對(duì)大力參遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 大力參經(jīng)口最大耐受劑量（MTD）均大于16.2g/kg。3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)的結(jié)果均為陰性。結(jié)論 在本實(shí)驗(yàn)條件下大力參對(duì)小鼠及大鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)未見毒性反應(yīng),同時(shí)未見遺傳毒性作用。

大力參;急性毒性;遺傳毒性

大力參又稱為燙通參或燙參,是將新鮮的人參用沸水浸煮或汽燙后曬干而成。大力參是介于生曬參和紅參之間的一種人參制品,所以,大力參具有生曬參和紅參的雙重特點(diǎn),其外皮類似生曬參,肉質(zhì)類似紅參樣。本文參照《新資源食品安全評(píng)價(jià)規(guī)程》[1］及《GB15193.1-2003食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》[2］的要求,通過(guò)急性毒性試驗(yàn)與遺傳毒性試驗(yàn)對(duì)大力參的毒理學(xué)進(jìn)行了初步研究,可作為其食用的安全性依據(jù)[3］。

1 材料與方法

1.1 受試物 大力參由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院左家特產(chǎn)研究所提供,粉碎,過(guò)100目篩,試驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配制成所需濃度。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與環(huán)境 清潔級(jí)昆明種小鼠與Wistar大鼠,購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（吉）-2003-0001。試驗(yàn)期間動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度（23±1）℃;相對(duì)濕度（50±10）%。

1.3 菌株 試驗(yàn)菌株均由華西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院檢測(cè)中心提供,4種菌株分別為TA97、TA98、TA100、TA102。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法［4］

1.4.1 大鼠急性毒性試驗(yàn) 取大鼠40只,雌雄各半,重130～140g,根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為2組（對(duì)照組與大力參組）,首次給藥前禁食16h,24h內(nèi)灌胃給予大力參3次（給藥濃度為0.27g/ml,給藥體積為20ml/kg·次）,累計(jì)給藥量為20.4g/kg,對(duì)照組給予同體積蒸餾水。給藥后,連續(xù)14d內(nèi)觀察并記錄大鼠中毒表現(xiàn)以及死亡等情況。

1.4.2 小鼠急性毒性試驗(yàn) 取40只小鼠,雌雄各半,重18～20g,根據(jù)其體質(zhì)量隨機(jī)分為2組（對(duì)照組與大力參組）,于24h內(nèi)灌胃給藥3次（第一次給藥前禁食16h）,給藥濃度為2.7g/10ml,給藥體積為40ml/kg·次,對(duì)照組給予同體積蒸餾水。給藥后連續(xù)觀察14d內(nèi)小鼠的外觀體征、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、飲水進(jìn)食、糞便、呼吸、腺體分泌、體質(zhì)量變化及死亡等情況。

1.4.3 Ames試驗(yàn) 采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型四種菌株進(jìn)行試驗(yàn)。本次試驗(yàn)采用平板摻入法,每種大力參受試品設(shè)配置成（含生藥量）8、40、200、1000、4000μg/皿共設(shè)5個(gè)劑量組;同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組（蒸餾水）、10%S9混合液為S9對(duì)照組;疊氮鈉（NaN3,20μg/皿）、敵克松（Dexon,50μg/皿）、2-氨基芴（2-AF,20μg/皿）、絲裂霉素C（MMC,20μg/皿）和1,8-二羥基蒽醌（50μg/皿）為陽(yáng)性突變對(duì)照組。在底層培養(yǎng)基平皿上寫上編號(hào),取已融化并在45℃水浴中保溫的頂層培養(yǎng)基（2ml）,依次加入受試物溶液0.1ml,測(cè)試菌液0.1ml,0.2mol·L-1磷酸緩沖液0.5ml（活化試驗(yàn)時(shí)加10%S9混合液0.5ml）,迅速混勻,傾于底層培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層上,平放固化,37℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。非活化試驗(yàn)（-S9）和活化試驗(yàn)（+S9）同時(shí)進(jìn)行,每個(gè)劑量做三個(gè)平行皿,試驗(yàn)重復(fù)二次。

1.4.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 取體質(zhì)量25～30g小鼠50只,根據(jù)其體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,每組10只,雌雄各半,即大力參受試品4.0g/kg、2.0g/kg、1.0g/kg三個(gè)劑量組,蒸餾水陰性（0.2ml/10g）對(duì)照組,環(huán)磷酰胺（40mg/kg）陽(yáng)性對(duì)照組。各組受試物均按0.02ml/g體積,分兩次（間隔24h）口服灌胃給藥,第二次給藥后6h斷頸法處死動(dòng)物。環(huán)磷酰胺組口服灌胃1次,給藥后24h處死。取股骨的骨髓加小牛血清混勻后推片,用甲醇溶液固定15min,使用吉姆薩液染色40min。光學(xué)顯微鏡下,每只鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE）,觀察含微核的PCE數(shù)（一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)微核,但都按一個(gè)細(xì)胞計(jì)）,計(jì)算其微核出現(xiàn)率（MNF）,以‰表示。并且計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中PCE/NCE（正染紅細(xì)胞）的比值。

1.4.5 小鼠精子畸形試驗(yàn) 取雄性小鼠25只,體質(zhì)量為25～35g,根據(jù)其體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,每組5只,即大力參受試品4.0g/kg、2.0g/kg、1.0g/kg三個(gè)劑量組,蒸餾水陰性（0.2ml/10g）對(duì)照組,環(huán)磷酰胺（60mg/kg）陽(yáng)性對(duì)照組。各組受試物均按20ml/kg體積灌胃給藥,每天給藥1次,連續(xù)5d。首次給藥后第35d處死動(dòng)物,取出雙側(cè)附睪放入盛有1ml生理鹽水的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,用鑷子輕輕撕開附睪表面包膜、輕輕搖動(dòng)附睪組織后、靜置5～10min,然后用鑷子夾去組織碎片。輕輕吹打懸液,用加樣器吸取100μl精子懸液滴在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔精子懸液中加入0.06ml 1%伊紅染液混勻染色15～20min后,取1滴于清潔的玻片上,均勻推片,空氣自然干燥,用中性樹脂封片每個(gè)精液樣本制片2張。在高倍鏡下檢查精子的形態(tài),每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子,計(jì)算畸變精子發(fā)生率（%）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 精子畸形試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn);其他試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠急性毒性試驗(yàn) 給藥后14d內(nèi),大鼠未見明顯中毒癥狀,且無(wú)一例死亡。14d后處死動(dòng)物,肉眼觀察大鼠各臟器未見異常。因給藥體積與濃度均已達(dá)最大限度,故大力參灌胃給藥大鼠的最大耐受劑量大于16.2g/kg,表明其無(wú)急性毒性作用。大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況見表1。

表1 大力參對(duì)大鼠急性毒性體質(zhì)量增長(zhǎng)的影響（x±s）

2.2 小鼠急性毒性試驗(yàn) 給藥后小鼠未見中毒癥狀,小鼠無(wú)一例死亡。14d后處死動(dòng)物,大體觀察小鼠各臟器均未見異常。給藥體積與濃度均已達(dá)最大限度,故未能求出小鼠灌胃給藥大力參的半數(shù)致死量。本品灌胃給藥小鼠的最大耐受劑量大于32.4g/kg,表明其無(wú)急性毒性作用。小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況見表2。

表2 大力參對(duì)小鼠急性毒性體質(zhì)量增長(zhǎng)的影響（x±s）

2.3 Ames試驗(yàn) 大力參受試品對(duì)TA 97、TA 98、TA 100、TA 102四種試驗(yàn)菌株,在加與不加S9混合液條件下均未引起基因組堿基置換或移碼突變,受試各劑量組、溶劑對(duì)照組及S9對(duì)照組對(duì)TA 97、TA 98、TA 100、TA 102菌株的回變菌落數(shù)同自發(fā)回變組菌落數(shù)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系。受試組與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異均非常顯著。重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果相同。表明大力參A-mes試驗(yàn)結(jié)果為陰性。試驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。

表3 大力參供試品的Ames試驗(yàn)結(jié)果（x±s,n=6）

表4 大力參供試品的Ames試驗(yàn)結(jié)果（x±s,n=6）

2.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 大力參各劑量組的小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率與陰性對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）,各劑量組與環(huán)磷酰胺對(duì)照組比較則差異顯著（P＜0.01）。各組PCE/NCE比值均在正常范圍內(nèi)。表明大力參對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞無(wú)誘發(fā)微核作用。結(jié)果見表5。

表5 大力參對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響（x±s）

2.5 小鼠精子畸形試驗(yàn) 大力參受試品各劑量組小鼠精子畸形率與陰性對(duì)照組比無(wú)顯著差異（P＞0.05）,陰性對(duì)照組和大力參各劑量組精子畸形率均顯著低于陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺（P＜0.01）。提示大力參對(duì)小鼠精子無(wú)致畸變作用。結(jié)果見表6。

表6 大力參對(duì)小鼠精子發(fā)生率的影響,n%）

表6 大力參對(duì)小鼠精子發(fā)生率的影響,n%）

注：*與陰性對(duì)照組比較,P＜0.01

組別劑量mg·kg-1雄性小鼠（只）受檢精子數(shù)（個(gè)）精子畸形數(shù)（個(gè)）精子畸x±s 形率陰性對(duì)照組（蒸餾水）大力參—500020.20±1.922.02 2.06 1.94 2.02環(huán)磷酰胺14.74 4000 2000 1000 60 55555 5000 5000 5000 5000 20.60±2.41 19.40±2.30 20.20±3.11 147.40±9.56*

3 討論

采用Ames試驗(yàn),通過(guò)突變的測(cè)試菌株,觀察大力參在基因水平上對(duì)遺傳物質(zhì)受損情況;微核試驗(yàn)是一種快速檢測(cè)染色體是否受到損傷的方法,用于鑒別對(duì)細(xì)胞遺傳物質(zhì)有損傷作用或干擾細(xì)胞有絲分裂的有毒物質(zhì);小鼠精子畸形試驗(yàn)通過(guò)觀察精子形態(tài),檢測(cè)受試物能否破壞精子正常形態(tài)的方法,檢查雄性哺乳動(dòng)物精子畸形率的高低[5-6］。三項(xiàng)試驗(yàn)可從體內(nèi)、體外較全面的反應(yīng)化學(xué)物對(duì)原核細(xì)胞與真核細(xì)胞、體細(xì)胞與生殖細(xì)胞的遺傳毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大力參無(wú)急性毒性反應(yīng),最大耐受劑量大于16.2g/kg。本實(shí)驗(yàn)條件下3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。因此,我們認(rèn)為上述的試驗(yàn)結(jié)果可以為大力參的食用安全性提供一定的依據(jù)。

[1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.新資源食品安全性評(píng)價(jià)規(guī)程[S］.2007.

[2］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法[S］.2003.

[3］國(guó)家新藥審評(píng)中心.藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[S］.2007：6-10.

[4］張濤,遲曉星,于利民,等.大豆異黃酮的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)[J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,32（6）：851-852.

[5］于燕,周玲,李安靜.山澤減肥食品的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)[J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版,2004,25（2）：162-164.

[6］王心如.毒理學(xué)基礎(chǔ)[M］.4版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2003：136.

Study on Acute Toxicity and Genetic Toxicity of Boiled Ginseng

Yang Xiaofeng1Chen Wenxue2Chen Zhifu1Yang Ming2?
(1 Tonghua Xinghua Pharmaceutical Co.,Ltd.,Tonghua,Jilin Province,134008,China; 2 New D rug Research Center of Jilin Academy of Chinese Medicine Science,Changchun,Jilin Province,130021,China)

Objective To determine the acute toxicity of boiled ginseng and provide experimental basis for its application.Methods Acute toxicity test was performance in mice and rats.The genetic toxicity of boiled ginseng was evaluated by Ames test（boiled ginseng at 4000,1000,200,40, 8μg each dish）,bone marrow micronucleus test and sperm shape abnormality test in mice.Results The acute oral maximum dose of boiled ginseng was greater than 16.2g/kg.Ames test,micronucleus test and sperm shape abnormality test shoved negative results.Conclusion Boiled ginseng was classified as non-toxic substance.It did not produce genetic toxicity.

Boiled ginseng;Acute toxicity test;Genetic toxicity test

10.3969/j.issn.1672-2779.2014.01.097

1672-2779（2014）-01-0152-03

??吳義紅 本文校對(duì)：于 艷

2013-11-05）

吉林省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目［No：20086042］

*通訊作者