淫羊藿苷對急性大腦中動脈梗死大鼠SDF-1及其受體CXCR-4的影響*

馬 立 吳明華 韓 漾 梁 森

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

淫羊藿苷是從淫羊藿中提取的異黃酮類化合物，其結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性神經(jīng)生長因子酪氨酸激酶（TrkB）受體激動劑類似。Trk受體表達增加，是內(nèi)源性神經(jīng)保護機制之一，其有助于挽救瀕死的神經(jīng)細胞［1］。本研究采用其類似結(jié)構(gòu)的淫羊藿苷進行研究，一方面可以為中醫(yī)藥治療中風(fēng)的作用機制進行探索，另一方面試圖為淫羊藿苷成為有效的神經(jīng)保護成分提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及模型制備 健康清潔級雄性SD大鼠 （由上海市動物實驗中心提供），體質(zhì)量（250±30）g，共 24只，隨機選取18只采用線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性缺血（MCAO）模型［2］，剩余 6 只手術(shù)步驟同 MCAO模型鼠，但只分離、暴露血管，不結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈，不插入栓線。隨機將MCAO大鼠分為低劑組6只、高劑量組6只、模型對照組6只，經(jīng)24 h后分別通過灌胃給藥法每日給予0.9%氯化鈉注射液（模型對照組）及淫羊藿苷溶液，其中低劑量組淫羊藿苷30mg/kg，高劑量組淫羊藿苷60mg/kg。

1.2 神經(jīng)功能評分 各組隨機選取3只作為14 d處死大鼠，對其采用神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準（NSS），每組于術(shù)后2 h，1 d，7 d，14 d進行評價。具體評分標(biāo)準如下：無任何異常行為，0分；提起鼠尾，健側(cè)前肢內(nèi)旋、肩內(nèi)收為損傷較輕，1分；上述癥狀基礎(chǔ)上，置于光滑平面，向健側(cè)推擋時阻力減弱或動物轉(zhuǎn)圈追尾爬行，為中度損傷，2分；提起鼠尾，向患側(cè)旋轉(zhuǎn)，損傷較嚴重，3分；動物處于精神抑制狀態(tài)，不能進行自發(fā)活動，4分。0分及 4分的大鼠不予入組［2］。

1．3 熒光定量RT-PCR檢測 以神經(jīng)功能評分改善最佳的組作為有效組，以模型組為參照。（1）組織總RNA的抽提。分別取損傷周邊部位和側(cè)腦室部位腦組織液氮冷凍，利用TRizol方法（Invitrogen公司提供）提取總RNA。（2）逆轉(zhuǎn)錄cDNA。將cDNA合成試劑盒（Fermentas）從-80℃冰箱取出，復(fù)融，等量取上述標(biāo)本所提取的總RNA各1mL，分別轉(zhuǎn)錄生成cDNA，反應(yīng)體系（總體積19μL）包括：作為模版的總RNA 4μL；Oligo（dT）。 0．5 μL）；加去離子水至總體積為 9 μL。 上述溶液置70℃，5min，然后放入冰水中冷卻，再加入5×RT 反應(yīng)緩沖液 4μL，dNTP 混合液 0．5μL， 加去離子水（去RNA酶處理），至總體積為19；上述溶液置于37℃水浴5min，然后加人逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 1μL，37℃孵育60min，然后加熱至95℃ 5min，置冰水中冷卻。（3）Real-time PCR。將制備好的cDNA進行PCR擴增，PCR 引物序列如下。 CXCR-4：P1：5′-GTTGCCTGAAC CCCATCCTCTA-3′。 P2：5′-GTGTCCACCCCGTTTCCCTTTG-3′。擴增長度：126bp。SDF-1：P1：5′-AGATGC CCCTGCCGATTCTTTG-3′。 P2：5′-TGTTGTTGCTTT T CAGCCTTGC-3′。 擴增長度：118bp。 b-actin：P1：5′-CTAAGGCCAACCGTGAAAAGAT-3′。P2：5′-ACCAGA GGCATACAGGGACAAC-3′。擴增長度：104 bp。擴增體系如下：SYBRGreen Mix 32．5 μL，上游引物 F 0．5 μL，下游引物 R 0．5μL，dd H2O 水 14．5μL，cDNA 模板 2μL，總體積 50μL， 在 Real-time檢測儀 （7500 Sequence Detection System）（ABI-7500，美國）進行 DNA 聚合反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性15 s，60℃退火35 s，40個循環(huán)后自動停止，模版內(nèi)含目的基因可直接讀出。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)均以（±s）表示，采用單因互方差分析，再用LSD法進行兩組之間均數(shù)比較。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組神經(jīng)功能評分結(jié)果 模型對照組在術(shù)后1 d，神經(jīng)功能缺損達到高峰，隨后有所緩解，這可能與其自愈功能有關(guān)。給藥組神經(jīng)功能缺損均有所改善，高劑量組與模型組神經(jīng)功能評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05），低劑量組在14 d時結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），根據(jù)實驗結(jié)果，選取模型對照組、低劑量組為有效組進行進一步基因檢測。

2．2 基因檢測結(jié)果 在第7日，低劑量組隨比模型組基因量增多，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；而在第14日，低劑量組大鼠梗死灶中SDF-1、CSCR-4的基因量顯著大于模型組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05)，由此可推斷，淫羊藿苷的起效時間或在7～14 d左右。

表1 各組大鼠個時間點神經(jīng)功能缺損評分比較（±s）

表1 各組大鼠個時間點神經(jīng)功能缺損評分比較（±s）

與模型對照組同時期比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。 下同。

組 別 n 2 h 1 d 7 d 14 d低劑量組 6高劑量組 6模型對照組 6 3．0±0．0 2．7±0．6 1．7±0．6 1．0±0．0△2．7±0．6 2．3±0．6 2．3±0．6 1．7±0．6 2．7±0．6 3．0±0．0 2．3±0．6 2．3±0．6空白對照組 60 0 0 0

表2 大鼠SDF-1/CXCR-4基因量檢測結(jié)果（±s）

表2 大鼠SDF-1/CXCR-4基因量檢測結(jié)果（±s）

組別 SDF-1 CXCR-4模型對照組 7 d 0．176±0．056 0．023±0．004（n＝6） 14 d 0．130±0．020 0．016±0．002低劑量組 7 d 0．185±0．042 0．024±0．007（n＝6） 14 d 0．160±0．019△△ 0．019±0．002△

3 討 論

中醫(yī)學(xué)將腦梗死其歸于 “中風(fēng)”、“偏枯”、“類中”、“卒中”等范疇，多因臟腑功能失調(diào)，元氣耗傷，憂思惱怒等使淤血阻滯，痰熱內(nèi)蘊，陽化風(fēng)動，血隨氣逆而上犯于腦，終致腦脈瘀滯所致［3］。 《內(nèi)經(jīng)》云“陽氣者，大怒則形色絕，而血苑于上，使人薄厥”。中風(fēng)病是一種多種致病因素長期作用于人體導(dǎo)致的疾病，其病因病機存在著復(fù)雜多變的特性，單以一種觀點難以把握中風(fēng)病的整體病因病機變化。目前公認中風(fēng)病存在6種常見的病理因素：虛（陰虛、血虛）、火（肝火、心火）、風(fēng)（肝風(fēng)、外風(fēng)）、痰（風(fēng)痰、濕痰）、氣（氣滯、氣逆）、瘀（血瘀）［4］。近年來隨著對中風(fēng)病因病機認識的不斷加深，中風(fēng)之證發(fā)現(xiàn)有陽氣不足者。蔡劍英等自制中風(fēng)康復(fù)丸治療中風(fēng)半身不遂36例，結(jié)果總有效率94．4%，該方中已提到淫羊藿具有改善循環(huán)的作用［5］。《內(nèi)經(jīng)》也提出“腦為髓之海，而腎主骨生髓”，而中醫(yī)學(xué)之“腎生髓”理論也與神經(jīng)系統(tǒng)密切關(guān)系。

淫羊霍味辛甘，性溫，入肝腎二經(jīng)，功擅補腎壯陽，祛風(fēng)除濕。朱良春教授常謂“仙靈脾溫而不燥，為燮理陰陽之佳品”。淫羊藿苷為中藥淫羊藿干燥莖葉的提取物，結(jié)構(gòu)上屬于8-異戊烯基黃酮醇苷類化合物。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，淫羊藿苷對神經(jīng)血管保護具有多重方面的效應(yīng)，主要表現(xiàn)在以下幾個方面。（1）抗缺血性腦損傷?？娠@著增加腦血流量，降低腦血管阻力；增強超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）活性，抗氧化；抑制線粒體腫脹，保護腦線粒體呼吸鏈；在體外刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖，遷移和血管生成，也可能直接刺激血管生成［6-7］；（2）炎癥反應(yīng)。有相關(guān)實驗通過培養(yǎng)離題的小膠質(zhì)細胞發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷具有明顯抑制NO、前列腺素（PGE）-2 活性氧（ROs）的釋放及促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-β（IL-β）和IL-6的mRNA表達，而且淫羊藿苷劑量依賴性地抑制LPS所致的誘導(dǎo)型NOS、COX-2蛋白表達機制［8］。（3）抗癡呆、抗衰老。（4）抗抑郁作用。（5）降低血同型半胱氨酸（HCY），拮抗HCY誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡，降低動脈硬化風(fēng)險［9］。

缺血性腦梗死可直接導(dǎo)致神經(jīng)組織破壞，引起神經(jīng)功能障礙，且損傷后的腦組織腫脹、缺血，進一步影響周圍組織，近年來對SDF-1及其受體CXCR-4在缺氧缺氧性腦損傷中的作用研究越來越受到人們的關(guān)注。SDF-1可以與其受體CXCR-4結(jié)合，形成SDF-1/CXCR-4信號軸，該信號軸在生物發(fā)育過程中發(fā)揮多種生物學(xué)功能，與胚胎發(fā)育、炎癥反應(yīng)、HIV感染、造血細胞調(diào)控以及干細胞的遷移等有密切關(guān)系。然而在缺血性腦梗死的過程中，該信號軸主要作用為3個方面。（1）SDF-1/CXCR-4信號軸調(diào)控內(nèi)源性祖細胞遷移。目前已經(jīng)有報道治療中風(fēng)的方法就是通過引進外源性神經(jīng)祖細胞到腦組織內(nèi)，這些細胞可能能夠參與腦組織的修復(fù)過程。并且人們已經(jīng)在中風(fēng)導(dǎo)致腦損害的區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)表達CXCR-4的神經(jīng)祖細胞，并且當(dāng)SDF-1/CXCR-4信號軸受干擾后能夠阻斷這一募集反應(yīng)［10］。說明該信號軸在腦損傷的過程中可以定向的調(diào)控神經(jīng)祖細胞的遷移，從而幫助修復(fù)損傷的腦組織。（2）促進新血管的生成。有大量實驗研究表明，SDF-1與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在促進新血管生成方面具有協(xié)同作用［11］，這種作用可能與內(nèi)皮前提細胞的招募有關(guān)。（3）提高機體抗缺氧能力。

本實驗中，通過建立大鼠MCAO模型，灌胃予不同劑量的淫羊藿苷，結(jié)果顯示低劑量淫羊藿苷對大鼠急性腦梗死期的神經(jīng)功能修復(fù)更為有效，將其作為有效組通過real-time PCR檢測證實該該組可一定程度上調(diào)SDF-1、CXCR-4基因表達，進而筆者認為淫羊藿苷具有神經(jīng)血管保護功能，這對在臨床應(yīng)用淫羊藿苷提供一定的實驗室依據(jù)，在今后的實驗研究中，筆者會針對淫羊藿苷在神經(jīng)保護方面做進一步的探討，淫羊藿苷或可成為新一代的神經(jīng)血管保護劑存在。

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