碳源氮源對(duì)雜色云芝產(chǎn)漆酶的影響*

朱友雙

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，山東日照276826)

朱友雙，男，漢族，1981年2月出生于山東省濟(jì)寧市。2011年12月畢業(yè)于山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物學(xué)專業(yè)，獲理學(xué)博士學(xué)位。2012年2月到濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系工作，主要從事纖維素酶、半纖維素酶、漆酶及過氧化物酶高產(chǎn)真菌篩選、誘變和相關(guān)酶代謝機(jī)理調(diào)控研究。目前以第一作者發(fā)表的SCI論文4篇。

漆酶，即對(duì)苯二酚∶氧氧化還原酶 (p-benzenediol:oxygen oxidoreductase,EC1.10.3.2)，屬于含銅的多酚氧化酶 (polyphenol oxidase)[1-2]，廣泛分布于植物、昆蟲、真菌和細(xì)菌中[3-5]。漆酶具有以氧氣為電子受體氧化酚類和部分非酚類化合物的特性以及非常寬的底物專一性[6]，因而漆酶在紙漿的去木質(zhì)化、染料污水處理、生物能源、生物傳感器、食品飲料行業(yè)以及有機(jī)合成和藥物合成中有廣泛的應(yīng)用前景[7-9]。

漆酶中研究最多、最為深入、應(yīng)用最為廣泛是真菌漆酶，目前人們研究的真菌漆酶主要集中在擔(dān)子菌 (Basidiomycota) 和子囊菌 (Ascomycota) 中，子囊菌和擔(dān)子菌多為白腐菌[6]。本文以實(shí)驗(yàn)室保存的高產(chǎn)漆酶菌株雜色云芝為研究對(duì)象，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)研究了碳源、氮源對(duì)該菌株合成漆酶的影響，優(yōu)化了培養(yǎng)條件，為漆酶工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌種 雜色云芝(Coriolusversicolor)系本實(shí)驗(yàn)室保藏，4℃保存于PDA斜面中。

1.1.2培養(yǎng)基 初始合成培養(yǎng)基 (1 L,W/V)：0.5% 葡萄糖， 0.5%酵母粉，0.0001%CuSO4，0.1% Tween 80，0.1% KH2PO4，0.05% MgSO4，0.004% CaCl2，0.0001% MnSO4，0.0001% ZnSO4，0.0001% FeSO4，0.0001%維生素B1，pH 調(diào)節(jié)至 5。研究不同碳源對(duì)漆酶合成的影響時(shí)，分別以0.5%的蔗糖、淀粉、碳酸氫鈉取代初始合成培養(yǎng)基的葡萄糖，其余營養(yǎng)物質(zhì)種類和含量同初始合成培養(yǎng)基。研究不同氮源對(duì)漆酶合成的影響時(shí)，分別以0.5%的蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨取代初始合成培養(yǎng)基中的酵母粉，其余營養(yǎng)物質(zhì)種類和含量同初始合成培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1菌種的活化 將雜色云芝接種于PDA平板，30℃培養(yǎng)活化7d。

1.2.2漆酶活性和生物量測(cè)定 取培養(yǎng)液經(jīng)過濾后，濾液于4 °C， 10000 g離心10 min，上清液用于測(cè)定漆酶活性。漆酶活性測(cè)定以ABTS為底物，每分鐘轉(zhuǎn)化 1 μmol底物所需酶量定義為一個(gè)酶活單位 (U)。

過濾濾紙?jiān)谶^濾前置于 60 ℃烘干至恒重，過濾除菌液后再次烘干至恒重，兩次重量的差值即為菌絲體的生物量。

1.2.3產(chǎn)酶和生長(zhǎng)時(shí)間曲線 為研究培養(yǎng)方式對(duì)雜色云芝生長(zhǎng)和漆酶產(chǎn)量的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)靜止培養(yǎng)和震蕩培養(yǎng)條件進(jìn)行了考察，生物量和漆酶活性間隔測(cè)量時(shí)間為1d。

1.2.4響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面分析方法，將實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面分析，通過二次函數(shù)進(jìn)行擬合，得到的預(yù)測(cè)模型，在各因素水平響應(yīng)值的基礎(chǔ)上，可以找出預(yù)測(cè)的響應(yīng)最優(yōu)值以及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件。在本文研究中，對(duì)影響漆酶產(chǎn)量的關(guān)鍵因素：蔗糖濃度、酵母粉濃度進(jìn)行優(yōu)化，利用Design Expert version 7.0 (State-Ease,Inc,Minneapolis,USA) 對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)的回歸分析，2個(gè)變量，5個(gè)水平(-α,-1,0,+1,+α)，變量的范圍為：蔗糖8～12 g/L；酵母粉5.5～8.5 g/L，響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，2個(gè)變量可近似為下列二次模型方程：

該方案共需 13 組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，其中包括 5 個(gè)中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，從而評(píng)估其影響系數(shù)，更好的預(yù)測(cè)產(chǎn)酶的最優(yōu)條件。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)方式對(duì)雜色云芝生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

靜止培養(yǎng)和搖床振蕩培養(yǎng)條件下雜色云芝的生產(chǎn)和產(chǎn)酶情況如圖1、圖2所示。結(jié)果表明，不論是靜止培養(yǎng)還是搖床振蕩培養(yǎng)，其生長(zhǎng)和繁殖都有延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期幾個(gè)階段，其中對(duì)數(shù)期菌體生長(zhǎng)最快，生長(zhǎng)旺盛；在搖床振蕩培養(yǎng)條件下雜色云芝產(chǎn)酶量和生物量都較靜止培養(yǎng)有所增加，且生長(zhǎng)時(shí)間明顯縮短。產(chǎn)酶時(shí)間均較菌體生物量的增長(zhǎng)時(shí)間略微滯后，隨著真菌進(jìn)入穩(wěn)定期產(chǎn)酶量達(dá)到最大，進(jìn)入衰減期后酶活性開逐漸減低。因此搖床振蕩培養(yǎng)更有利于雜色云芝的產(chǎn)酶發(fā)酵。分析認(rèn)為，振蕩培養(yǎng)可以使菌體與培養(yǎng)基充分接觸，滿足菌體的生長(zhǎng)需要，其次加速營養(yǎng)物和氧氣在細(xì)胞間的傳質(zhì)效率，增加了溶氧量，利于菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。而在靜止培養(yǎng)條件下菌體可能會(huì)沉在底部，減緩生長(zhǎng)速度，進(jìn)而影響的酶的生產(chǎn)。

圖1 振蕩培養(yǎng)與靜止培養(yǎng)條件下雜色云芝產(chǎn)酶曲線

圖2 振蕩培養(yǎng)與靜止培養(yǎng)條件下雜色云芝生長(zhǎng)曲線

2.2 不同碳源對(duì)漆酶活性的影響

在振蕩培養(yǎng)條件下考察了葡萄糖、蔗糖、淀粉和碳酸氫鈉4種碳源對(duì)雜色云芝合成漆酶的影響(圖3)，結(jié)果表明，碳源對(duì)漆酶活性具有重要影響，有機(jī)碳源和無機(jī)碳源對(duì)酶活性的影響具有顯著性差異(P<0.05，n=3)，有機(jī)碳源培養(yǎng)酶活性相對(duì)較高。無機(jī)碳源碳酸氫鈉培養(yǎng)不利于雜色云芝的吸收利用和漆酶的分泌，酶活性相對(duì)較低。有機(jī)碳源是雜色云芝合成漆酶的優(yōu)選碳源。

圖3 不同碳源對(duì)漆酶合成的影響

2.3 不同氮源對(duì)漆酶活性的影響

研究了酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨和硫酸銨四種氮源對(duì)雜色云芝漆酶活性的影響(圖4)。結(jié)果表明，其中以酵母提取物為氮源時(shí)漆酶活性最高，胰蛋白胨次之，蛋白胨較低，無機(jī)氮源硫酸銨最低，不同氮源對(duì)酶活性影響具有顯著性差異(P<0.05，n=3)。有機(jī)氮源酵母提取物營養(yǎng)相對(duì)豐富，可為微生物生長(zhǎng)提供維生素、氨基酸及生長(zhǎng)因子等多種營養(yǎng)成分，雜色云芝生長(zhǎng)快，有利于漆酶的分泌；硫酸銨營養(yǎng)成分單一，雜色云芝利用吸收慢，影響生長(zhǎng)，不利于漆酶的合成。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果后面的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)選擇酵母粉作為氮源。

圖4 不同氮源對(duì)漆酶合成的影響

2.4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Eq.(1)，我們用Design Expert version 7.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二項(xiàng)式Eq.(2)：

Y=-2135.61 + 158.29X1+ 437.97X2+ 2.13X1X2-8.49X12-31.99X22Eqs.2

X1：Sucrose,X2：east extract,

回歸分析結(jié)果如表1，模型決定系數(shù)R2 其值越接近 1，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果擬合性越好[10]。本模型的R2=0.9888，與 1 非常接近，表明模型的可靠性和適合度非常高。此外，模型的適用性還可以進(jìn)一步通過最小二乘擬合殘差分析來進(jìn)行判斷[11]。從圖5中可以看出實(shí)驗(yàn)實(shí)際值和預(yù)測(cè)值非常相似，均勻分布在直線兩側(cè)，說明模型也是可信的、有效的，能夠適用于研究碳源氮源對(duì)雜色云芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

P<0.05 表明該模型項(xiàng)目顯著

圖5 模型適合度檢驗(yàn)圖

兩因素對(duì)漆酶產(chǎn)量的 3-D響應(yīng)面分析圖與等高線圖如圖6所示，根據(jù)微分學(xué)的極大值和極小值原理對(duì) Eqs.2進(jìn)行微積分，可以得到如下偏微分方程：

Y=-2135.61+158.29X1+437.97X2+2.13X1X2-8.49X12-31.99X22

?Y/?X1=158.29+2.13X2-16.98X1Eqs.3

?Y/?X2=437.97+2.13X1-63.98X2Eqs.4

當(dāng) ( ?Y/?X1)、(?Y/?X2)等于零的時(shí)候，響應(yīng)面漆酶產(chǎn)量最高。根據(jù)代數(shù)的方法對(duì)Eqs.3和Eqs.4求解得各變量的值分別為：X1=10.2，X2=7.2。根據(jù)擬合得到的二項(xiàng)式計(jì)算得到的預(yù)測(cè)最高漆酶產(chǎn)量為248.14 u/L。根據(jù)最優(yōu)液態(tài)發(fā)酵條件 (蔗糖=10.2 g/L，酵母粉=7.2 g/L) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到真實(shí)最高漆酶量為254.26 u/L，與預(yù)測(cè)值的差別小于 5%，表明預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值相吻合，模型是有效的。

圖6 蔗糖與酵母粉對(duì)酶活的響應(yīng)面分析圖與等高線圖

3 結(jié)論

綜上所述單因素和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明振蕩培養(yǎng)適合雜色云芝合成漆酶，碳源和氮源對(duì)雜色云芝發(fā)酵生產(chǎn)漆酶有很大的影響，漆酶合成的合適碳源為蔗糖，合適氮源為酵母粉，培養(yǎng)基中碳氮源的最佳含量為：蔗糖 10.2 g/L，酵母粉 7.2 g/L。培養(yǎng)基優(yōu)化后漆酶的產(chǎn)量比初始培養(yǎng)基提高了接近2倍，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也表明預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值相吻合，證明使用響應(yīng)面法對(duì)雜色云芝培養(yǎng)基碳氮源的優(yōu)化是有效的、可靠的。優(yōu)化結(jié)果為漆酶的液態(tài)發(fā)酵提供了指導(dǎo)，可以在發(fā)酵過程中合理的添加碳源、氮源，有效地提高漆酶產(chǎn)量并降低發(fā)酵成本。

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