表達(dá)hTERT基因大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的類(lèi)肝樣細(xì)胞分化能力研究

馬 迪 施敏敏 嚴(yán)佶祺 陳雪華 計(jì) 駿 張佳年 彭承宏

·論著·

表達(dá)hTERT基因大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的類(lèi)肝樣細(xì)胞分化能力研究

馬 迪 施敏敏 嚴(yán)佶祺 陳雪華 計(jì) 駿 張佳年 彭承宏

目的對(duì)表達(dá)hTERT基因的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）進(jìn)行成瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及類(lèi)肝樣細(xì)胞分化能力的鑒定。方法將表達(dá)hTERT基因的大鼠BMSCs進(jìn)行裸鼠致瘤試驗(yàn)評(píng)估成瘤風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)序貫法誘導(dǎo)成肝分化，于誘導(dǎo)后觀察細(xì)胞形態(tài)變化、檢測(cè)ALB和AFP的表達(dá)、糖原染色鑒定糖原儲(chǔ)備能力。結(jié)果裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)提示表達(dá)hTERT基因的大鼠BMSCs無(wú)成瘤風(fēng)險(xiǎn)。成肝誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)閳A形；ALB僅在誘導(dǎo)第21天部分陽(yáng)性表達(dá)，AFP在誘導(dǎo)第14天起陽(yáng)性表達(dá)；糖原染色陽(yáng)性。結(jié)論表達(dá)hTERT基因的大鼠BMSCs無(wú)致瘤風(fēng)險(xiǎn)，且具有類(lèi)肝樣細(xì)胞的分化能力。

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類(lèi)肝樣細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）由于具備多向分化潛能，在特定誘導(dǎo)下可向多種細(xì)胞分化并行使相應(yīng)功能，使其在組織工程和移植治療中的具有極強(qiáng)的潛在價(jià)值[1-2]。另外，BMSCs具有很強(qiáng)的自我增殖能力，且能分泌多種細(xì)胞因子，在細(xì)胞移植技術(shù)的支持下，BMSCs對(duì)于治療終末期肝病具有誘人的前景[3]。但由于缺乏端粒酶的活性，BMSCs的生存時(shí)間以及分化能力會(huì)隨著細(xì)胞的增殖分裂而受到影響，外源性的hTERT導(dǎo)入可以提高BMSCs端粒酶活性，增殖分裂能力得到增強(qiáng)，且仍能保持其定向分化能力。有報(bào)道認(rèn)為，轉(zhuǎn)染hTERT的大鼠BMSCs向神經(jīng)元分化的能力未受影響[4]，且經(jīng)hTERT基因改造的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞同樣具備成肝分化能力[5]。我們?cè)谇捌谘芯恐幸勋@得穩(wěn)定表達(dá)hTERT基因的大鼠BMSCs，其生物學(xué)特性已得到鑒定分析[6]，本研究則通過(guò)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)鑒定，對(duì)其成肝分化能力以及致瘤風(fēng)險(xiǎn)予以評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

穩(wěn)定表達(dá)hTERT基因的大鼠BMSCs（上海消化外科研究所保存并提供）；HepG2細(xì)胞（上海消化外科研究所細(xì)胞庫(kù)）；4周齡裸鼠（BK實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）；10%FBS、L-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；ALB一抗、AFP一抗（SantaCruz，美國(guó)）；HGF、FGF-4（PeproTech，美國(guó)）；ITS（賽業(yè)生物科技有限公司）；HRP標(biāo)記鼠兔通用二抗、DAB顯色試劑盒（DAKO，丹麥）；糖原染色試劑盒（上海榕柏生物技術(shù)有限公司）；恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus，德國(guó)）；顯微成像系統(tǒng)DS-U1（Nikon，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表達(dá)hTERT基因的BMSCs成瘤風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估

裸鼠20只，隨機(jī)分為4組。裸鼠體內(nèi)分別注射以下細(xì)胞懸液：HepG2細(xì)胞（HepG2組）、穩(wěn)定表達(dá)hTERT的BMSCs（MSC-hTERT組）、空載GFP的BMSCs（MSC-GFP組）和原代培養(yǎng)的MSC（MSC組）。

致瘤實(shí)驗(yàn)前一天，取數(shù)個(gè)1.5 mL EP管，錫紙密封包裹后，高壓消毒備用；致瘤實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，胰酶消化收集MSC-hTERT、MSC-GFP、MSC、HepG2細(xì)胞，計(jì)數(shù)并制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度1×107cells/mL。

無(wú)菌條件下細(xì)胞懸液加入EP管內(nèi)，錫紙密封后，4℃條件轉(zhuǎn)運(yùn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，紫外線照射20 min后轉(zhuǎn)入屏障環(huán)境。

各組裸鼠右前肢近腋窩皮下處注射相應(yīng)組別細(xì)胞懸液0.2 mL，繼續(xù)屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)2~3周，觀察其局部注射點(diǎn)腫瘤生成情況，并評(píng)估致瘤風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)。

1.2.2 表達(dá)hTERT的BMSCs定向分化為類(lèi)肝樣細(xì)胞能力的鑒定

依據(jù)文獻(xiàn)[7]所述采用序貫成肝誘導(dǎo)方案，整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程共分為3個(gè)階段。

第一階段：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+FGF-4+HGF，誘導(dǎo)起第1～3天FGF-4和HGF的終濃度分別為10 ng/m L和20 ng/m L。

第二階段：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+HGF，HGF濃度同前。誘導(dǎo)起第4～6天。

第三階段：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+1×ITS+地塞米松+HGF，誘導(dǎo)起第7天起至誘導(dǎo)結(jié)束HGF濃度同前，地塞米松終濃度為20μg/L。

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：L-DMEM培養(yǎng)基+10%FBS，加入青霉素及鏈霉素雙抗。

取狀態(tài)良好的MSC-hTERT，接種于6孔板內(nèi)，密度為2×104cells/cm2，待細(xì)胞融合達(dá)50%時(shí)，開(kāi)始誘導(dǎo)分化，設(shè)對(duì)照組。誘導(dǎo)組于不同階段添加相應(yīng)誘導(dǎo)液，對(duì)照組以基礎(chǔ)培養(yǎng)液代替誘導(dǎo)液，每3天換液。

誘導(dǎo)開(kāi)始后，倒置顯微鏡觀察兩組細(xì)胞形態(tài)變化情況，記錄形態(tài)變化時(shí)間。于誘導(dǎo)開(kāi)始第7天、第14天、第21天、第28天收集誘導(dǎo)組及對(duì)照組細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞爬片、固定、封閉、添加相應(yīng)一抗及二抗，完成免疫組化染色并測(cè)定誘導(dǎo)組及對(duì)照組各時(shí)間節(jié)點(diǎn)AFP和ALB蛋白表達(dá)情況。

收集第35天的誘導(dǎo)組及對(duì)照組細(xì)胞，制成細(xì)胞爬片。按糖原過(guò)碘酸雪夫染色液使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行糖原染色實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞糖原染色結(jié)果，鑒定兩組細(xì)胞的糖原合成能力。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)hTERT基因的BMSCs成瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

于各組裸鼠皮下注射相應(yīng)細(xì)胞，飼養(yǎng)2~3周后觀察發(fā)現(xiàn)，HepG2組裸鼠全部于注射部位形成皮下新生物，大小約在0.5 cm左右，而MSC-hTERT、MSC-GFP、MSC三組裸鼠注射部位皮下均未見(jiàn)腫瘤新生物形成，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未發(fā)生實(shí)驗(yàn)裸鼠死亡。

2.2 表達(dá)hTERT基因的BMSCs分化為類(lèi)肝樣細(xì)胞的鑒定結(jié)果

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)的變化

成肝誘導(dǎo)初期，兩組細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯差別，但在第三階段誘導(dǎo)開(kāi)始后，誘導(dǎo)組部分細(xì)胞長(zhǎng)度逐漸縮短，形狀變?yōu)闄E圓形或不規(guī)則形，誘導(dǎo)3周后大部分細(xì)胞形態(tài)變?yōu)轭?lèi)圓形或者圓形，細(xì)胞體積也較對(duì)照組細(xì)胞更大（圖1A）。而對(duì)照組細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中形態(tài)基本保持長(zhǎng)梭形，未有明顯改變（圖1B）。

圖1 細(xì)胞形態(tài)觀察（200×）Fig.1 Cell morphology of MSC-hTERT(200×)

2.2.2 AFP及ALB的免疫組化染色結(jié)果

誘導(dǎo)組在分化誘導(dǎo)過(guò)程中除第21天AFP染色呈部分陽(yáng)性外（圖2A），其余各時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)陰性結(jié)果，而ALB在誘導(dǎo)第14天起開(kāi)始出現(xiàn)弱陽(yáng)性染色，第21天起呈現(xiàn)陽(yáng)性染色（圖2B），并隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而陽(yáng)性染色進(jìn)一步明顯。對(duì)照組無(wú)論AFP還是ALB在實(shí)驗(yàn)中各時(shí)間點(diǎn)染色均呈陰性結(jié)果。

圖2 成肝誘導(dǎo)第21天免疫組化染色結(jié)果（100×）Fig.2 Results of IHC staining at D21 after induction(100×)

2.2.3 糖原染色結(jié)果

誘導(dǎo)第35天行糖原染色，誘導(dǎo)組細(xì)胞糖原染色呈陽(yáng)性，表現(xiàn)為胞漿中彌漫的紅色或者紫紅色致密顆粒物質(zhì)（圖3A）。對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)陰性，胞漿內(nèi)未見(jiàn)紅色陽(yáng)性顆粒物或僅有少量淺紅色物質(zhì)（圖3B）。

圖3 糖原染色結(jié)果（100×）Fig.3 Results of PAS staining(100×)

3 討論

由于BMSCs具備自我更新能力，經(jīng)定向誘導(dǎo)后具有分化為肝細(xì)胞和類(lèi)肝樣細(xì)胞的潛能[8]，為終末期肝病的治療帶來(lái)了希望。多項(xiàng)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，移植BMSCs可顯著改善受體肝功能，降低死亡率[9-10]。但是BMSCs無(wú)法長(zhǎng)期增殖分裂的問(wèn)題，促使對(duì)構(gòu)建端粒酶永生化BMSCs細(xì)胞系開(kāi)展研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)基因工程技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)hTERT基因的BMSCs細(xì)胞系，能保持原有的生物學(xué)特性，且增殖分裂能力加強(qiáng)，但是該類(lèi)經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞是否安全無(wú)瘤，是否仍具備了定向分化為肝樣細(xì)胞的能力，仍值得研究及討論。

細(xì)胞的永生化與成瘤風(fēng)險(xiǎn)總是一對(duì)矛盾體，雖然hTERT介導(dǎo)的永生化細(xì)胞系其安全性更高，成瘤風(fēng)險(xiǎn)降低[11]，但是基因改造后細(xì)胞可能的潛在致瘤性仍不容忽視。已有研究將端粒酶活性作為腫瘤檢測(cè)的一個(gè)新標(biāo)志，同時(shí)有研究顯示異常表達(dá)的hTERT與多項(xiàng)腫瘤成正相關(guān)[12-13]。為此本實(shí)驗(yàn)中選用了HepG2細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行裸鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn)。經(jīng)3周觀察，HepG2細(xì)胞種植于裸鼠皮下后均形成腫瘤，而MSC-hTERT組、MSC-GFP組和MSC組細(xì)胞經(jīng)皮下接種后均無(wú)成瘤傾向，顯示了該類(lèi)轉(zhuǎn)hTERT基因的BMSCs細(xì)胞系安全穩(wěn)定的無(wú)瘤特性。

多向分化潛能是BMSCs的一個(gè)重要特性，其向肝細(xì)胞的定向分化以及在細(xì)胞移植治療方面的研究已逐漸成為熱點(diǎn)[14]。由于BMSCs向肝樣細(xì)胞的定向分化需要突破胚層限制，因此這一跨胚層分化的實(shí)現(xiàn)依賴(lài)于復(fù)雜的誘導(dǎo)微環(huán)境。以往的研究主要關(guān)注于各類(lèi)不同誘導(dǎo)因子的單獨(dú)或聯(lián)合作用，而對(duì)于BMSCs的接種密度和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)配方、誘導(dǎo)順序等，存在不同看法。通過(guò)比對(duì)不同研究報(bào)道[15]，我們確定了以HGF+FGF-4作為主要成肝誘導(dǎo)因子，并輔以地塞米松和ITS，通過(guò)序貫誘導(dǎo)方法，完成對(duì)BMSCs向類(lèi)肝樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子在定向分化中具有重要作用，也是分化研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。HGF是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在肝臟的發(fā)育成熟和再生過(guò)程中扮演重要角色，同時(shí)其在誘導(dǎo)干細(xì)胞向類(lèi)肝樣細(xì)胞分化過(guò)程中也具有明確而顯著的作用[16]。而FGF-4作為體內(nèi)一種重要的信號(hào)分子，協(xié)同HGF對(duì)促進(jìn)肝細(xì)胞的發(fā)育及再生發(fā)揮了無(wú)法比擬的作用。另外，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中添加的胰島素鐵硒傳遞蛋白（Insulin-Transferrin-Selenium，ITS）和地塞米松兩類(lèi)輔助誘導(dǎo)因子，可在分化過(guò)程中誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)重要轉(zhuǎn)錄因子HNF，以便更好地控制肝細(xì)胞的發(fā)育和行使相關(guān)功能。

在誘導(dǎo)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)轭?lèi)圓形或不規(guī)則形，而這種變化也在誘導(dǎo)開(kāi)始2~3周后更為明顯。為了證明這種形態(tài)變化的細(xì)胞是否具備了類(lèi)肝樣細(xì)胞的功能，我們選擇了AFP和ALB這兩個(gè)肝系細(xì)胞標(biāo)志物，在誘導(dǎo)的不同階段通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察其表達(dá)的變化。免疫組化染色提示AFP僅在誘導(dǎo)第3周出現(xiàn)弱陽(yáng)性結(jié)果，而ALB的陽(yáng)性表達(dá)隨著誘導(dǎo)的進(jìn)行得到進(jìn)一步加強(qiáng)。作為肝細(xì)胞分化早期表面標(biāo)志的AFP，由肝前體細(xì)胞分泌，隨著肝細(xì)胞的分化成熟其表達(dá)逐漸減少，而ALB則是成熟肝細(xì)胞的典型標(biāo)志，結(jié)合以上兩項(xiàng)結(jié)果，我們推斷在誘導(dǎo)初期，表達(dá)hTERT基因的BMSCs可能定向分化為不成熟肝前體細(xì)胞并表達(dá)了一定量的AFP，隨著進(jìn)一步的誘導(dǎo)，此類(lèi)細(xì)胞逐漸發(fā)育為更成熟的類(lèi)肝樣細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)ALB這一反應(yīng)肝細(xì)胞代謝活性的標(biāo)志物。糖原合成能力是成熟肝細(xì)胞特有的功能，在糖原染色實(shí)驗(yàn)中我們進(jìn)一步驗(yàn)證了表達(dá)hTERT基因的BMSCs誘導(dǎo)后具備糖原合成能力，間接提示其已具有部分成熟肝細(xì)胞的功能。

本實(shí)驗(yàn)提示，表達(dá)hTERT的BMSCs安全無(wú)致瘤性，同時(shí)經(jīng)定向誘導(dǎo)后具備分化為類(lèi)肝樣細(xì)胞的能力，并顯示出成熟肝細(xì)胞的部分特性，結(jié)合hTERT賦予細(xì)胞的“永生化”可能性，其將為組織工程以及肝細(xì)胞移植治療的研究提供新的思路和補(bǔ)充。

[1]Otto WR,Wright NA.Mesenchymal stem cells:from experiment to clinic[J].Fibrogenesis Tissue Repair,2011,4(1):20.

[2]李佳濱,張文杰,崔福齋,等.P17-BMP2多肽促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].組織工程與重建外科雜志, 2012,8(2):65-68.

[3]Yagi K,Kojima M,Oyagi S,et al.Application of mesenchymal stem cells to liver regenerative medicine[J].Yakugaku Zasshi, 2008,128(1):3-9.

[4]張曉輝,張建寧,康春生,等.hTERT正、反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2006,5 (3):217-221.

[5]Liang XJ,Chen XJ,Yang DH,et al.Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells by hTERT gene transfection in vitro[J].Cell Biol Int,2012,36(2): 215-221.

[6]馬迪,嚴(yán)佶祺,彭承宏,等.表達(dá)hTERT的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性研究[J].組織工程與重建外科,2013,9(5):256-259.

[7]Snykers S,Vanhaecke T,Papeleu P,et al.Sequential exposure to cytokines reflecting embryogenesis:the key for in vitro differentiation of adult bone marrow stem cells into functional hepatocyte-like cells[J].Toxicol Sci,2006,94(2):330-341.

[8]Schwartz RE,Reyes M,Koodie L,et al.Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells[J].J Clin Invest,2002,109(10):1291-1302.

[9]Van Poll D,Parekkadan B,Cho CH,et al.Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo[J].Hepatology,2008,47(5): 1634-1643.

[10]Kuo TK,Hung SP,Chuang CH,et al.Stem cell therapy in liver disease:parameters governing the success of using bone marrow mesenchymalstem cells[J].Gastrenterology,2008,134(7):2111-2121.

[11]Toouli CD,Huschtseha LI,Neumann AA,et a1.Comparison of human mammary epithelial cell immortalized by simian virus 40 T Antigen or by the telomerase catalytic subunit[J].Oncogene, 2002,21(1):128-139.

[12]Bzarov AV,Hines WC,Mukhopadhyay R,et al.Telomerase activation by c-Myc in human mammary epithelial cells requires additional genomic changes[J].Cell Cycle,2009,8(20):3373-3378.

[13]張業(yè)偉,牛堅(jiān),趙何偉,等.干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及臨床意義[J].中華肝膽外科雜志,2012,18(1):37-39.

[14]Piryaei A,Valojerdi MR,Shahsavani M,et al.Differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into hepatocytelike cells on nanofiber and their transplantation into a carbon tetrachloride-induced liver fibrosis model[J].Stem Cell Rev, 2011,7(1):103-118.

[15]Pournasr B,Mohamadnejad M,Bagheri M,et al.In vitro differentiation of human bone marrow mesenchymal Stem Cells into hepatocyte-like Cells[J].Arch Iran Med,2011,14(4):244-249.

[16]Oh SH,Miyazaki M,Kouchi H,et al.Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat bone marrow cells into a hepatocyte lineage in vitro[J].Biochem Biophys Res Commun, 2000,279(2):500-504.

Hepatic Differentiation Potential of hTERT Gene Transfected Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

MA Di,SHI Minmin,YAN Jiqi,CHEN Xuehua,JI Jun,ZHANG Jianian,PENG Chenghong.Department of General Surgery, Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,200025 Shanghai,China.Corresponding author:YAN Jiqi (E-mail:yanjiqi@aliyun.com).

ObjectiveTo estimate the oncogenicity of hTERT gene transfected rat BMSCs and to identify its hepatic differentiation potential.MethodsThe oncogenicity of hTERT gene transfected rat BMSCs was estimated by tumorigenesis test in nude mouse.Then the hTERT gene transfected rat BMSCs were induced for hepatic differentiation by sequential method.The change of cell morphology was observed,the expression of ALB and AFP were detected,and the ability of glycogen storage was tested by PAS stain.ResultsTumorigenesis test of nude mouse suggested no oncogenic risk of hTERT gene transfected rat BMSCs.After hepatic induction,the induced cells became round in shape.A few ALB(+)cells were observed only at D21 after induction while more and more AFP(+)cells were observed started from D14 after induction.The result of PAS stain was positive.ConclusionThe hTERT gene transfected rat BMSCs have the potential of hepatic differentiation with no oncogenicity.

Human telomerase reverse transcriptase;Bone marrow mesenchymal stem cells;Hepatocyte-like cells

Q813.1+1

A

1673－0364（2014）05－0247－04

2014年5月7日；修復(fù)日期：2014年6月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.05.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（81070358）。

200025上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院普外科。

嚴(yán)佶祺（E-mail：yanjiqi@aliyun.com）。