HPLC法測(cè)定人血漿中煙酸和煙尿酸含量方法探究

陳冬

摘 要：

[目的]建立一個(gè)同時(shí)測(cè)定人血漿中煙酸及其活性代謝物煙尿酸的RP-HPLC方法，并用于臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。[方法]取1ml人血漿于一干凈試管中，加入20μl內(nèi)標(biāo)甲硝唑，渦旋10s，再加入3ml乙腈，渦旋1min，3000rpm下離心5min，將上清全部取出置于另一干凈試管，加入3ml氯仿，渦旋5min，3000rpm下離心5min，取水溶層（上層）200μl和100μl流動(dòng)相混勻，取20μl進(jìn)樣，檢測(cè)波長(zhǎng)為262nm。[結(jié)果]煙酸，煙尿酸和內(nèi)標(biāo)甲硝唑的保留時(shí)間為4.5min，7.5min和105min。煙酸和煙尿酸日內(nèi)與日間精密度的RSD均小于11%，煙酸和煙尿酸在50ng/ml到5000ng/ml范圍內(nèi)線性均良好，煙酸的其他代謝物如煙酰胺、N-甲基煙酰胺等無(wú)干擾。

關(guān)鍵詞：

煙酸和煙尿酸;色譜法;高效液相;血樣處

中圖分類(lèi)號(hào)：

TB

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-3198（2014）24-0225-03

煙酸為B族維生素之一，對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)有著重要的作用。很多文獻(xiàn)都報(bào)道了煙酸在脂代謝中的藥理作用和煙酸在治療高脂血癥中的廣泛應(yīng)用，但關(guān)于煙酸及其代謝產(chǎn)物的藥動(dòng)學(xué)研究卻鮮有報(bào)道，在國(guó)內(nèi)同時(shí)測(cè)定煙酸和煙尿酸的方法還未見(jiàn)報(bào)道。為更好地研究煙酸降血脂作用和副作用的機(jī)制，建立一個(gè)簡(jiǎn)便快捷準(zhǔn)確測(cè)量生物樣品中煙酸及其代謝產(chǎn)物濃度的方法是很有意義和非常必要的。

在煙酸測(cè)定初級(jí)階段，一系列技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，如微生物法、色度法、傳統(tǒng)柱色譜法、氣液色譜法等，在過(guò)去的20年里，高效液相色譜法得到了普遍應(yīng)用。本法即在前人基礎(chǔ)上用高效液相色譜法測(cè)定人血漿中煙酸及其活性代謝產(chǎn)物煙尿酸的含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters高效液相色譜系統(tǒng)（Waters 600泵，Waters 2487型紫外檢測(cè)器，N2000型色譜工作站）;AUW120 D電子分析天平;臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;IKA VORTEX Genious 3渦旋器。

1.2 藥品與試劑

煙酸為原料藥;煙尿酸標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.9%，批號(hào)為20081101;甲醇為色譜純（天津市四友生物技術(shù)有限公司）;水為液相用水;其它試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Plastil ODS C18柱（150mm×4.6mm，5μm）;流動(dòng)相：甲醇：5mmol/L己烷磺酸鈉：冰醋酸（12∶100∶1.2）;流速：1.0ml/min;

檢測(cè)波長(zhǎng)：262nm;靈敏度：0.01AUFS;進(jìn)樣量：20μl;柱溫：常溫。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）煙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：密稱(chēng)定煙酸標(biāo)準(zhǔn)品1005mg，倒入10ml容量瓶中，用液相水定容，得1mg/ml煙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）煙尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱(chēng)定煙尿酸標(biāo)準(zhǔn)品10.02mg，倒入10ml容量瓶中，用液相水定容，得1mg/ml煙尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。（3）煙酸、煙尿酸混合溶液的配制：1mg/ml的煙酸與煙尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各取2.5ml，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得250μg/ml混合溶液。

2.3 不同濃度煙酸與煙尿酸混合液的配制

（1）1mg/ml的煙酸與煙尿酸儲(chǔ)備液各取1ml，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得100μg/ml混合溶液;（2）1mg/ml的煙酸與煙尿酸儲(chǔ)備液各取500μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得50μg/ml混合溶液;（3）1mg/ml的煙酸與煙尿酸儲(chǔ)備液各取200μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得20μg/ml混合溶液;（4）100μg/ml的煙酸煙尿酸混合溶液取500μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得5μg/ml混合溶液;（5）100μg/ml的煙酸煙尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液取200μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得2μg/ml混合溶液;（6）100μg/ml的煙酸煙尿酸混合溶液取100μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得1μg/ml混合溶液。

2.4 QC血漿的制備

（1）取空白血漿9ml，加入10μg/ml的混合溶液90μl，劇烈渦旋10min，得血藥濃度0.1μg/ml的質(zhì)控血漿，即QC1血漿;（2）取空白血漿9ml，加入100μg/ml的混合溶液90μl，劇烈渦旋10min，得血藥濃度1.0μg/ml的質(zhì)控血漿，即QC2血漿;（3）取空白血漿9ml，加入250μg/ml的混合溶液90μl，劇烈渦旋10min，得血藥濃度2.5μg/ml的質(zhì)控血漿，即QC3血漿。

2.5 樣品處理

（1）取人血漿1ml，加入30μl純磷酸酸化，再加入500μg/ml的甲硝唑內(nèi)標(biāo)溶液20μl，渦旋10s;（2）加入3ml乙腈，渦旋1min，3000rpm下離心5min;（3）將上清液全部取出，置于另一干凈試管中，加入3ml氯仿，渦旋5min，3000rpm離心5min;（4）取水溶層200μl，加入100μl流動(dòng)相，混勻進(jìn)樣20μl即可。

2.6 試驗(yàn)血漿的制備

精密量取人血漿1ml，分別加入煙酸和煙尿酸混合溶液1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、50μg/ml和100μg/ml各50μl，使二者的濃度分別為0.05μg/ml，0.1μg/ml，0.25μg/ml，1.0μg/ml，2.5μg/ml，5.0μg/ml，按“樣品處理”方法處理后測(cè)定。

2.7 回收率試驗(yàn)

取空白血漿1ml，加入液相水70μl（注：標(biāo)準(zhǔn)溶液50μl和內(nèi)標(biāo)溶液20μl），按“樣品處理”方法處理，取出水溶層70μl，而后分別加入低、中、高2μg/ml、20μg/ml和50μg/ml的混合溶液50μl，再加入20μl內(nèi)標(biāo)溶液，小心攪勻后進(jìn)樣。一個(gè)濃度配制4份，分別進(jìn)樣，每次的峰面積與當(dāng)天精密度實(shí)驗(yàn)中的相應(yīng)峰面積平均值的比值，即為回收率。

2.8 數(shù)據(jù)處理

（1）用峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算血樣中尿酸濃度;（2）以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對(duì)血漿藥物濃度進(jìn)行回歸，分別求出煙酸和煙尿酸各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果

3.1 色譜行為

在本實(shí)驗(yàn)條件下，煙酸、煙尿酸和內(nèi)標(biāo)分離良好，保留時(shí)間分別為4.5min、7.5min、10.5min。（圖1、圖2）

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對(duì)血漿藥物濃度進(jìn)行回歸，分別求出煙酸（圖3）和煙尿酸（圖4）各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3 煙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 煙尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 實(shí)驗(yàn)方法專(zhuān)屬性

取六種不同來(lái)源的人空白血漿1ml，按“樣品處理”方法處理后進(jìn)樣，觀察內(nèi)源物質(zhì)的出峰情況，在本實(shí)驗(yàn)條件下，煙酸，煙尿酸和內(nèi)標(biāo)有較大的色譜峰和較好的分離度，血漿中雜質(zhì)基本不干擾。

3.4 日內(nèi)、日間精密度

將低、中、高3個(gè)濃度（0.1，1.0，2.5μg/ml）的血漿樣品按“樣品處理”方法操作，分別在同1天內(nèi)測(cè)定6次和每天測(cè)定1次連續(xù)3天，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果如表1、表2所示，精密度均較好。

表1 煙酸日內(nèi)、日間精密度

濃度日內(nèi)日間

（μg/ml）濃度（μg/ml）RSD（%）濃度（μg/ml）RSD（%）

0.10.0947、0.0909

0.1069、0.0945

0.0997、0.0960

5.70.1011

0.0971

0.1173

10.2

1.00.9960、1.0936

1.0110、0.9187

1.0198、0.9897

5.61.0830

1.0048

0.9835

5.1

2.52.4753、2.1655

2.1515、2.2656

2.2948、2.2597

5.12.4745

2.5420

2.3165

4.7

表2 煙尿酸日內(nèi)、日間精密度

濃度日內(nèi)日間

（μg/ml）濃度（μg/ml）RSD（%）濃度（μg/ml）RSD（%）

0.10.1120、0.1073

0.1107、0.1017

0.1006、0.0991

5.20.1070

0.1125

0.1051

3.6

1.00.9207、0.9854

1.0662、0.9707

0.9228、0.9188

6.01.1159

0.9641

1.0736

7.5

2.52.2379、2.3250

2.1941、2.3055

2.2990、2.2843

2.22.4007

2.2743

2.3801

2.9

回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如表3、表4）。

表3 煙酸的回收率

濃度回收率（%）均值（%）RSD（%）

（μg/ml）1234

0.1

85.5

87.5

87.3

93.9

88.5

4.18

1.0

104.7

106.3

111.2

110.9

108.3

3.02

2.5

99.9

103.5

103.4

97.8

101.2

2.77

表4 煙尿酸的回收率

濃度回收率（%）均值（%）RSD（%）

（μg/ml）1234

0.1109.1

115.1

119.1

118.1

115.3

3.92

1.0

113.1

116.0

115.8

115.9

115.2

1.21

2.5

99.9

104.3

103.2

101.1

102.1

1.95

4 討論

4.1 實(shí)驗(yàn)干擾

煙酸為B族維生素之一，為正常人體不可或缺的微量物質(zhì)，正常人體血漿中即有內(nèi)源性的煙酸，對(duì)本實(shí)驗(yàn)中煙酸峰的測(cè)定有一定干擾，故在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)扣除煙酸的內(nèi)源性本底。但通過(guò)專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6種不同來(lái)源中內(nèi)源性煙酸的濃度均低于50ng/ml，對(duì)實(shí)驗(yàn)干擾小，可以忽略不計(jì)。

4.2 色譜條件

流動(dòng)相選擇：實(shí)驗(yàn)初期，體外測(cè)定煙酸和煙尿酸時(shí)，用甲醇∶10mmol/L磷酸二氫鈉（4∶100，磷酸調(diào)pH值）作流動(dòng)相也有很好的分離效果，但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)由于流動(dòng)相有機(jī)相比例過(guò)低，對(duì)煙酸峰有很大干擾。故最后采用甲醇∶5mmol/L己烷磺酸鈉∶冰醋酸（12∶100∶1.2）作為流動(dòng)相，結(jié)果表明，樣品的峰形對(duì)稱(chēng)，保留時(shí)間適宜。

4.3 血樣處理

（1）蛋白沉淀劑。實(shí)驗(yàn)中曾用過(guò)直接用丙酮沉淀蛋白后進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)有高濃度雜質(zhì)干擾，故不用。之后選擇用乙腈沉淀蛋白，效果好，干擾少。（2）調(diào)節(jié)pH值?；仡櫿麄€(gè)實(shí)驗(yàn)，血樣處理時(shí)調(diào)節(jié)pH值是至關(guān)重要的一步，詳見(jiàn)下文“pH值的影響”分析。

4.4 煙酸和煙尿酸的性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)方法選擇的影響

（1）水溶性。

煙酸和煙尿酸的水溶性強(qiáng)，有機(jī)溶媒無(wú)法將藥物從血漿中提取出來(lái)，故液液萃取不能得到滿(mǎn)意效果。本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)用乙腈沉淀蛋白，將上清全部取出，再用氯仿反提，取水溶層（即上層）進(jìn)樣。用氯仿反提不僅去除了部分干擾，而且有起到了濃縮，提高靈敏度的作用。

（2）酸性。

煙酸和煙尿酸均為弱酸性物質(zhì)，易與血漿中存在的堿性物質(zhì)結(jié)合，故血漿處理過(guò)程中應(yīng)加一定量酸酸化血漿。同時(shí)，二者對(duì)酸度非常敏感，響應(yīng)值、保留時(shí)間以及峰形都受酸度的影響。在“pH值的影響”一項(xiàng)中詳細(xì)講解。

4.5 pH值的影響

（1）流動(dòng)相pH值。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，煙酸和煙尿酸的響應(yīng)值隨著pH值的降低而升高，并且pH值的變化對(duì)二者的保留時(shí)間和峰形也有影響?？紤]到pH值過(guò)低對(duì)色譜住的損壞，本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相pH值在3.0和3.2之間。

（2）酸對(duì)血漿處理的影響。

本實(shí)驗(yàn)在血漿預(yù)處理中有兩步調(diào)節(jié)酸度的步驟。

第一步：加乙腈前用磷酸酸化血漿，實(shí)驗(yàn)初未加磷酸酸化時(shí)，煙酸峰被掩蓋，煙尿酸峰良好但響應(yīng)值極低。之后采用100%，75%，50%和25%的磷酸酸化，響應(yīng)值差別不大，但100%峰形稍好。

第二步：進(jìn)樣前水溶層與定量流動(dòng)相混勻。實(shí)驗(yàn)初不加流動(dòng)相直接進(jìn)樣，二者均出現(xiàn)肩峰。之后各取水溶層300μl，200μl，100μl與100μl流動(dòng)相混勻進(jìn)樣觀察，發(fā)現(xiàn)取200μl與100μl流動(dòng)相混勻峰形較好。

5 結(jié)論

本方法血樣處理簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，可用于煙酸和煙尿酸在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。

參考文獻(xiàn)

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