趨化因子10在慢性非萎縮性胃炎、胃癌癌前病變及胃癌中的表達(dá)及意義*

何 甜，唐 慧，郭 強(qiáng)△，楊 慧

(云南省第一人民醫(yī)院：1.消化內(nèi)科；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/云南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.病理科，昆明 650032)

胃癌(GC)是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，雖然近年來(lái)世界范圍內(nèi)GC總體發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，但其發(fā)病率和病死率在各類惡性腫瘤中均居首位，嚴(yán)重威脅著人民的身體健康。目前，尋找特異性的治療靶點(diǎn)，成為GC治療研究中心的一個(gè)熱點(diǎn)。而隨著腫瘤與分子學(xué)關(guān)系研究的不斷深入，其中趨化因子10(CXCL10)與其受體CXCR3構(gòu)成的生物學(xué)軸成為目前研究熱點(diǎn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，眾多腫瘤細(xì)胞均可過(guò)度表達(dá)CXCL10，其可能對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為起到重要的調(diào)控作用，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖炎癥效應(yīng)等[1-2]，但關(guān)于CXCL10與GC的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。而眾所周知，GC癌變的發(fā)展演變過(guò)程是從慢性非萎縮性胃炎(chronic non-atrophy gastritis,CNAG)→慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)→腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM)→不典型增生(dysplasia,Dys)→GC，其中CAG→IM→Dys作為GC發(fā)生、發(fā)展的重要階段，被統(tǒng)稱為癌前病變(precancerous lesions，PL)[3]。本研究采用SP免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CXCL10蛋白在GC PL組織中的表達(dá)變化，以期進(jìn)一步揭示GC癌變的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2006年6月至2009年12月140例樣本，其中CNAG 20例、PL 60例(CAG伴IM 20例、CAG伴輕-中度Dys 20例、CAG伴重度Dys 20例)；GC 60例(高分化GC 20例、中低分化40例)。20例CNAG，男9例、女11例，平均(51.1±14.9)歲；60例PL，男46例、女14例，平均(55.9±22.1)歲；60例GC，男42例、女18例，平均(60.6±26.4)歲。所有病例術(shù)前均無(wú)化療、放療及免疫治療史。本研究獲得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)及患者的知情同意。全部研究樣本均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)，GC分類參照日本胃癌學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[4]。判斷標(biāo)準(zhǔn)：CNAG，發(fā)現(xiàn)水腫，線狀充血，紅斑，并經(jīng)胃黏膜活檢證實(shí)黏膜表層上皮細(xì)胞變性或壞死脫落形成糜爛，固膜有淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)；CAG，內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)有明顯的柱狀上皮化生和皺襞肥厚，并經(jīng)胃黏膜活檢證實(shí)有杯狀細(xì)胞存在和腺體細(xì)胞增生肥大；GC，手術(shù)切除樣本中，取無(wú)壞死的癌組織，經(jīng)常規(guī)病理切片證實(shí)為GC。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)CXCL10蛋白的表達(dá) CXCL10抗體購(gòu)自Abcam公司，檸檬酸型抗原修復(fù)緩沖液(pH6.0，MVS-0100)、超敏SP試劑盒(KIT-9710)、DAB試劑盒(DAB-0031)、蘇木素體細(xì)胞快速染色液(CTS-1099)、磷酸鹽緩沖液(PBS-0061)和中性樹(shù)膠(DAB-0033)均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。

標(biāo)本采用40 g/L 甲醛固定，石蠟包埋，免疫組織化學(xué)采用SP法。切片厚度4 μm，置于載玻片上；常規(guī)脫蠟，不同濃度的乙醇中脫水至水洗；30 mL/L過(guò)氧化氫甲醇溶液室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；山羊血清室溫下孵育20 min；檸檬酸型抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)微波修復(fù)；PBS洗后滴加一抗(工作濃度為1∶500)50 μL，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗；滴加SP試劑盒中生物素標(biāo)記的二抗，置37 ℃ 30 min，PBS沖洗；滴加鏈霉親和素辣根過(guò)氧化物酶50 μL，置37 ℃ 30 min，PBS沖洗；DAB室溫下顯色；PBS終止顯色；清水沖洗10 min后蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片、照相。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.2圖像采集和結(jié)果判讀 切片用Olympus BX 50光學(xué)顯微鏡觀察、攝像。用HMIAS-2000高清晰度全自動(dòng)彩色圖像分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司)采集圖像并對(duì)各CXCL10蛋白表達(dá)的陽(yáng)性染色面積及染色強(qiáng)度進(jìn)行分析。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野取平均值。結(jié)果判讀采用雙盲法，并由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立讀片評(píng)定CXCL10蛋白染色結(jié)果，評(píng)估參考文獻(xiàn)[5]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用綜合評(píng)分法，根據(jù)染色強(qiáng)度及著色面積進(jìn)行判斷。染色強(qiáng)度：0分，無(wú)顯色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。在400倍光鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)不同的視野，按顯色細(xì)胞比例評(píng)分，0分：<5%；1分：5%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：>75%。根據(jù)以上兩項(xiàng)指標(biāo)得分的和作為判斷表達(dá)結(jié)果，若積分小于或等于1為陰性，2～4為弱陽(yáng)性，5～7為強(qiáng)陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1CXCL10蛋白在CNAG、PL和GC中的表達(dá)結(jié)果 CXCL10蛋白在這些胃黏膜組織中均有表達(dá)，表達(dá)部位集中在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中。在CNAG、PL和GC中CXCL10蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率分別為：10%(2/20)、26.67%(16/60)、71.67%(43/60)；且CXCL10蛋白在CNAG、PL和GC中表達(dá)多為淡黃色顆粒(圖1)，隨著CNAG-PL-GC演進(jìn)過(guò)程中，CXCL10蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，表達(dá)面積逐漸增大。

A：CAG；B：CAG伴IM；C：CAG伴Dys；D：GC。

圖1 CXCL10蛋白在CNAG 、PL和GC中的表達(dá)情況(蘇木素復(fù)染×400)

2.2CXCL10蛋白在不同病理類型中的表達(dá)陽(yáng)性率的比較 χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CXCL10蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在GC組中異常升高，極顯著高于CNAG及PL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而CXCL10蛋白在PL、CNAG兩種病理組織中陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3CXCL10蛋白表達(dá)與PL、 GC患者各臨床病理特征的關(guān)系 將PL分為CAG伴IM及CAG伴Dys， CXCL10蛋白在兩種病理組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為15.0%、32.5%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同時(shí)將Dys分為輕中度、重度不典型增生，CXCL10蛋白在兩種病理組織中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分別將GC中CXCL10蛋白陽(yáng)性和陰性病例的各臨床病理參數(shù)，包括性別、年齡、腫瘤分化程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， CXCL10蛋白在GC組中的表達(dá)與年齡無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在男性GC組中，CXCL10蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中低分化GC中CXCL10蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于高分化GC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 CXCL10在CNAG、PL、GC病理組織中的陽(yáng)性表達(dá)

3 討 論

趨化因子是一組結(jié)構(gòu)同源，功能相似，且能趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子分泌型蛋白。在趨化因子的分子中都有4個(gè)保守的半胱氨酸(C)，根據(jù)靠近分子氨基端(N端) 的前兩個(gè)C 間是否插入其他氨基酸,將他們分為CXC、C-C、C及CX3C四類亞族[6]，而CXCL10又稱為干擾素Y誘導(dǎo)蛋白10，屬于CXC類趨化因子，是1985年Luster等[7]首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的小分子細(xì)胞因子，其受體為CXCR3，含有2個(gè)亞群，即CXCR3A及CXCR3B。CXCR3B含有416個(gè)氨基酸，較CXCR3A在NH2-端的包外區(qū)長(zhǎng)52個(gè)氨基酸殘基，此種結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致了CXCR3兩種亞群功能的顯著不同[8]。當(dāng)CXCL10與其受體CXCR3結(jié)合，經(jīng)GTP耦聯(lián)蛋白在機(jī)體炎癥、腫瘤、自身免疫等疾病中發(fā)揮重要的生理和病理效應(yīng)。尤其在腫瘤形成的生物行為中發(fā)揮雙向作用：(1)通過(guò)抗腫瘤免疫性，抗腫瘤血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而起到抗腫瘤的作用；(2)通過(guò)促炎效應(yīng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖在腫瘤生成、發(fā)展的生物行為過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9-10]。近年來(lái)，隨著CXCL10蛋白研究的不斷深入，CXCL10蛋白抗腫瘤機(jī)制日漸明朗，但亦有不少研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的CXCL10蛋白與大多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)，國(guó)內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[1-2，11]，而在GC及其癌前病變中尚無(wú)CXCL10蛋白表達(dá)及臨床病理參數(shù)相關(guān)性的報(bào)道。

本研究采用免疫組織化學(xué)SP法和圖像分析定量，檢測(cè)了作為PL的CAG、IM、Dys這三類組織類型中CXCL10蛋白的表達(dá)情況，并同時(shí)檢測(cè)了其在CNAG中的表達(dá)情況。以期從腫瘤細(xì)胞自身的CXCL10蛋白表達(dá)水平方面解釋由PL發(fā)展為GC的可能機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，CXCL10蛋白在CNAG、PL、GC三類病理組織中均有表達(dá)(陽(yáng)性表達(dá)率分別為10.00%、26.67%、71.67%)，而在GC病理組織中的陽(yáng)性表達(dá)率尤其升高,顯著高于PL及CNAG組；在PL、CNAG兩種病理組織中CXCL10 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)研究顯示，CXCL10蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在CNAG-PL-GC過(guò)程中逐漸升高，尤其在GC階段,提示蛋白CXCL10有可能在胃黏膜的發(fā)育中起一定的作用，結(jié)果進(jìn)一步佐證了PL發(fā)展成GC是一個(gè)逐漸演變的過(guò)程。并且CXCL10蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制在乳腺癌的研究中得以證實(shí)：在癌組織中，CXCL10與CXCR3A受體結(jié)合后，能在組織微環(huán)境中起作用，同時(shí)還能通過(guò)自主分泌的方式作用于腫瘤細(xì)胞本身，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，另一方面，當(dāng)CXCL10蛋白與血管內(nèi)皮細(xì)胞CXCR3B受體結(jié)合則抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，當(dāng)患者組織細(xì)胞CXCR3A受體占優(yōu)勢(shì)，起保護(hù)作用的CXCR3B受體處于劣勢(shì)時(shí)，CXCL10蛋白與前者的優(yōu)勢(shì)結(jié)合介導(dǎo)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。

本研究還將CXCL10蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，在GC組中男性CXCL10蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與GC發(fā)病年齡無(wú)關(guān)。該結(jié)果再次證實(shí)我國(guó)男性發(fā)病率高于女性，而隨著生活及飲食習(xí)慣等影響，GC發(fā)病年齡越年輕化，各年齡階段均可見(jiàn)GC的發(fā)生，該結(jié)果提示臨床應(yīng)該加強(qiáng)普查。同時(shí)中低分化GC組中CXCL10蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于高分化組，該結(jié)果提示CXCL10的表達(dá)可能與GC的分化類型相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)不同分化類型CXCL10的表達(dá)在GC預(yù)后預(yù)測(cè)、個(gè)體化治療中可能具有一定的意義。此外，本研究還將PL按CAG是否伴腸化及是否伴異型增生分為兩個(gè)大組比較，發(fā)現(xiàn)CXCL10蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平在兩組病理組織中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CXCL10蛋白的表達(dá)與CAG是否伴異型增生及腸化無(wú)關(guān)。同時(shí)將萎縮性胃炎伴不典型增生分為輕中度不典型增生及重度不典型增生，發(fā)現(xiàn)CXCL10蛋白的表達(dá)在輕中度、重度不典型增生的陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯差異，說(shuō)明CXCL10蛋白的表達(dá)與增生程度無(wú)關(guān)。

綜上所述，CXCL10蛋白與GC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且 CXCL10蛋白表達(dá)與GC的分化程度具有顯著相關(guān)性， CXCL10蛋白極有可能成為GC診斷預(yù)后標(biāo)志物之一，同時(shí)利用分子生物學(xué)技術(shù)，阻斷CXCL10/CXCR3反應(yīng)軸，可能成為GC治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

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