免疫佐劑應(yīng)用的研究進(jìn)展

呂茂利鄭冬凌袁 利

免疫佐劑應(yīng)用的研究進(jìn)展

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免疫佐劑；研究進(jìn)展；應(yīng)用

免疫佐劑是同抗原同時(shí)或預(yù)先注入機(jī)體，能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答或改變其免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。自1926年Glenny首先應(yīng)用鋁鹽粘附白喉類毒素至今，已廣泛應(yīng)用于人、獸疫苗，從而拉開了佐劑使用的序幕。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，疫苗的類型已經(jīng)從最初的滅活疫苗、減毒疫苗發(fā)展為亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗。但這些新型疫苗往往免疫效果不理想，免疫原性較弱，因此需要免疫佐劑的輔助以加強(qiáng)免疫效果。本文就常見免疫佐劑及其研究進(jìn)展做一綜述，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 鋁鹽佐劑

鋁鹽佐劑具有安全、價(jià)廉、合成簡單等優(yōu)點(diǎn)，是最早允許可用于人用疫苗的佐劑。目前常見的鋁鹽佐劑包括氫氧化鋁、氟化鋁等。王大勇等[1]證實(shí)氫氧化鋁吸附百日咳抗原對(duì)家兔和嚙齒動(dòng)物IgE抗體的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，氫氧化鋁還能非特異性激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1（IL-1），并激活補(bǔ)體，選擇性地誘導(dǎo)細(xì)胞因子[如白細(xì)胞介素-4（IL-4）]的產(chǎn)生。鋁鹽雖然具有良好的安全性，但亦有缺點(diǎn)：①只能增強(qiáng)體液免疫。②能誘導(dǎo)產(chǎn)生IgE抗體，導(dǎo)致注射部位出現(xiàn)紅腫、紅斑、硬結(jié)等不良反應(yīng)。③鋁在人體內(nèi)長時(shí)間蓄積，還能導(dǎo)致腦病。④不耐低溫，也不能冷凍保存。故鋁鹽佐劑已逐漸被一些新型佐劑所取代。

2 弗氏佐劑

弗氏佐劑是目前應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)用佐劑，分為弗氏完全佐劑（freund's complete adjuvant,FCA）和弗氏不完全佐劑（freund's incomplete adjuvant, FIA）。FIA是油劑（石蠟油或植物油）與乳化劑（羊毛脂或吐溫80）相混合而成，當(dāng)與抗原混合時(shí)即形成油包水乳劑。在FIA中加入死的分枝桿菌，即形成FCA。通常FCA用于初次免疫，F(xiàn)IA用于加強(qiáng)免疫。弗氏佐劑具有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)效應(yīng)，既可加強(qiáng)體液免疫又可加強(qiáng)細(xì)胞免疫。但動(dòng)物多次注射弗氏佐劑后，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，常引起肉芽腫、無菌性炎癥、過敏反應(yīng)等佐劑疾病。故弗氏佐劑常用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

3 微生物佐劑

3.1 細(xì)菌毒素 細(xì)菌毒素是由菌體分泌的一種具有復(fù)雜性的天然蛋白質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌外毒素具有免疫增強(qiáng)作用，其中常見的有霍亂腸毒素（cholera enterotoxin,CT）和大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat labile enterotoxin,LT）。二者結(jié)構(gòu)有80%的相似性，均由一個(gè)A亞單位和五個(gè)B亞單位構(gòu)成。A亞單位為毒性單位，其中A1肽鏈具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，A2肽鏈與B亞單位結(jié)合參與受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用中的轉(zhuǎn)位作用。B亞單位為結(jié)合單位，能特異地識(shí)別腸皮細(xì)胞上的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CT和LT能誘導(dǎo)APC表面表達(dá)B7-1、B7-2，為CD4+Th細(xì)胞活化提供協(xié)調(diào)刺激信號(hào)。CT通過IL-4誘導(dǎo)增強(qiáng)Th2細(xì)胞的免疫反應(yīng)性，LT通過產(chǎn)生干擾素-γ（IFN-γ），增強(qiáng)Th1細(xì)胞的免疫反應(yīng)性以及非IL-4依賴性Th2細(xì)胞的免疫反應(yīng)性。CT、LT具有毒性作用，雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，以CT作為疫苗佐劑通過鼻腔免疫小鼠，只是在嗅覺神經(jīng)內(nèi)沉積而未對(duì)大腦造成明顯的病理損傷。但是為了確保其使用的安全性，還是試圖通過多種方法降低CT、LT的毒性作用，如去除毒素中的毒性亞單位A、通過定點(diǎn)突變的方式降低LT和CT的毒性、Lycke等構(gòu)建的基因融合蛋白CTA1-DD等。Mi-Young Kim等[2]構(gòu)建了霍亂毒素B亞單位（cholera toxin B subunit,CTB）與登革熱病毒的共識(shí)包膜蛋白結(jié)構(gòu)域III（envelope protein domain III,cEDIII）融合基因在轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織中表達(dá)的模型，通過在小鼠模型中的M細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)，顯示出其結(jié)合腸上皮細(xì)胞、腸相關(guān)淋巴組織的M細(xì)胞的活性，表明CTB-cEDIII融合蛋白通過以抗原為目標(biāo)的黏膜免疫系統(tǒng)來改善免疫應(yīng)答是可行的。

3.2 脂質(zhì)體 脂質(zhì)體是單層磷脂或由數(shù)層可溶性物質(zhì)隔開的呈同心圓狀排列的連續(xù)多層磷脂所組成的微球體，具有佐劑兼載體功能，可包裹各種抗原和佐劑。革蘭陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）屬于類脂質(zhì)。類脂質(zhì)可儲(chǔ)存抗原，緩慢釋放可溶性抗原，并能將抗原呈遞給巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。類脂質(zhì)的免疫增強(qiáng)活性主要體現(xiàn)在對(duì)免疫系統(tǒng)中細(xì)胞成分的作用，如增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性，以及各種淋巴因子、細(xì)胞因子的釋放[3]。單磷酸類脂A（monophosphoryl lipid A,MPL）是LPS的衍生物，保留了LPS的大部分免疫刺激活性而無毒性，成為較LPS安全的佐劑材料。MPL通過合成釋放白細(xì)胞介素-2（IL-2）和IFN-γ誘發(fā)Thl類反應(yīng)，MPL還可以促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的移動(dòng)和成熟。

3.3 CpG基序 CpG基序是一些以未甲基化的CpG為核心的寡聚脫氧核苷酸（oligodeoxynucleotides,ODN），CpG基序主要存在于病毒、細(xì)菌及無脊椎動(dòng)物的基因組中，脊椎動(dòng)物基因組中較少[4]。CpG基序具有強(qiáng)烈的免疫激活功能，可通過其Toll樣受體9（toll like receptor-9,TLR-9）激活天然免疫應(yīng)答并誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，能改善抗原提呈細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)細(xì)胞因子/趨化因子，促進(jìn)特異性抗原的免疫支持和特異性抗原的過繼免疫應(yīng)答，啟動(dòng)免疫刺激的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，活化B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞；促進(jìn)NK細(xì)胞、T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞的成熟、分化、增殖。Sungyoul Hong等[5]將CpG作為佐劑加入多發(fā)性骨髓瘤基因疫苗中對(duì)小鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其抗腫瘤免疫的效果優(yōu)于粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）。應(yīng)用CpG基序后，靈長類動(dòng)物出現(xiàn)的最嚴(yán)重的不良反應(yīng)是全身補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，進(jìn)而導(dǎo)致致死性血管通透性升高。慶幸的是，這種反應(yīng)在CpG血清濃度低于40～50 μg/ml時(shí)不會(huì)發(fā)生。此外，CpG結(jié)合于血栓素可以導(dǎo)致活化部分凝血酶時(shí)間（activeated partial thr- omboplastin time,APTT）的延長。應(yīng)用CpG是否會(huì)引起自身免疫病也是一個(gè)備受關(guān)注的問題，但是缺乏大規(guī)模臨床對(duì)照試驗(yàn)。從目前積累的資料看，CpG致自身免疫病的可能低于IFN-α[6]。由于CpG在腸道內(nèi)很快被降解，所以不能口服或在腸內(nèi)使用。因此曹福嫻等[3]把CpG3’末端和3’末端連接起來，以抵抗核酸酶的降解，這就是第二代免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸（immunomodulatory oligonucleotides,IMO）。

3.4 熱休克蛋白 熱休克蛋白（heat shock protein, HSP）又稱熱應(yīng)激蛋白或應(yīng)激蛋白，是細(xì)胞或生物體在一些應(yīng)激原。HSP是目前研究得較多的一種免疫佐劑，在疫苗中具有抗原載體和免疫佐劑的雙重作用，廣泛存在于原核、真核生物[7]。根據(jù)分子量的大小和同源程度，HSP分為五大家族：小分子量HSP（sHSP）、中等分子量的HSP 60家族、HSP 70家族、HSP 90家族、HSP 110家族[8]。HSP 70已成為目前研究較多的免疫佐劑。徐云升等[9]通過在體外構(gòu)建HSP 70與人乳頭瘤病毒（human papilloma virus,HPV）16型E711-20配體的復(fù)合物免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)HSP 70能增強(qiáng)HPV 16型E 711-20配體的免疫效應(yīng)，證實(shí)其有較好的免疫佐劑作用。Xiao-Ping Wang等[10]構(gòu)建了由HSP 72與甲胎蛋白（AFP）構(gòu)成的治療性蛋白質(zhì)復(fù)合物疫苗，發(fā)現(xiàn)AFP和HSP 72協(xié)同作用，能明顯增加AFP特異性CD8+T細(xì)胞的反應(yīng)并對(duì)表達(dá)AFP的腫瘤有明顯的抵抗作用。HSP 70可以預(yù)防炎性損傷。

4 殼聚糖

殼聚糖是一種陽離子多聚糖，由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰作用而形成。殼聚糖具有黏膜吸附特性，可與黏液中帶負(fù)電荷的糖蛋白形成氫鍵而產(chǎn)生粘附作用，增加與黏膜接觸的時(shí)間，以延緩抗原的清除，促進(jìn)抗原穿過黏膜屏障并與黏膜下的淋巴組織發(fā)生作用。殼聚糖能夠提高巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的活性和積聚能力，抵抗病菌的侵入，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（delayed hypersensitivity,DTH）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cells,CTL）反應(yīng)?？诜缓鞍卓乖臍ぞ厶?，可引起白細(xì)胞介素-10（IL-10）釋放及黏膜IL-4、TGF-β的表達(dá)，并激活脾臟的CD3+T細(xì)胞，明顯上調(diào)黏膜Th2免疫反應(yīng)。Zhiwei Sui等[11]將禽流感病毒基質(zhì)蛋白2（matrix protein 2,M2）的有效成分sM2表達(dá)于大腸桿菌，以殼聚糖為佐劑鼻腔免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)殼聚糖能有效提高sM2疫苗的療效。

5 細(xì)胞因子

大部分佐劑多通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生來發(fā)揮其佐劑活性，如細(xì)菌毒素、殼聚糖等。因此可以直接添加細(xì)胞因子作為免疫佐劑。常見的可作為佐劑的細(xì)胞因子有IL-1、IL-2、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）、GM-CSF及趨化因子等。細(xì)胞因子佐劑中應(yīng)用最為廣泛的是IL-2。IL-2可作用于多種效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)免疫應(yīng)答有廣泛的上調(diào)作用。IL-12在體內(nèi)主要參與機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，是一種重要的誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Thl細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，是一個(gè)應(yīng)用較為廣泛的細(xì)胞因子佐劑。IL-1能促進(jìn)胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞激活、增殖，表達(dá)IL-2受體，分泌細(xì)胞因子；能促進(jìn)前B細(xì)胞增殖分化、表達(dá)膜表面免疫球蛋白（surface membrane immunoglobulin,SmIgM）和C3b受體。GM-CSF主要通過調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞的數(shù)量和功能來增強(qiáng)免疫應(yīng)答強(qiáng)度，促進(jìn)IL-2分泌及CD4+T細(xì)胞增生，從而使抗體及CD8+T細(xì)胞增加。趨化因子促進(jìn)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、白細(xì)胞移動(dòng)和歸巢、血管生成，參與血細(xì)胞的生成和淋巴細(xì)胞的生成[12]。

6 免疫刺激復(fù)合物

ISCOM（immune stimulating complexes, ISCOM）是由皂角苷Quil A的糖苷、膽固醇、抗原及其他類脂質(zhì)，在去垢劑作用下混合而成的直徑為30～70 nm的立體籠狀結(jié)構(gòu)。其中Quil A本身就具有黏膜佐劑效應(yīng)。ISCOM是一種有較高免疫活性的脂質(zhì)小體，刺激B細(xì)胞反應(yīng)，增加抗體產(chǎn)生；誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)，刺激產(chǎn)生CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子L-12。因此其可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答同時(shí)增強(qiáng)體液免疫，特別適合小分子或半抗原而賦予高度免疫原性，從而持久而強(qiáng)烈的產(chǎn)生免疫應(yīng)答。ISCOM還具有抵抗胃酸和膽汁的作用，經(jīng)眼黏膜、鼻、口免疫，產(chǎn)生廣泛刺激，誘導(dǎo)局部和全身免疫應(yīng)答。其抗體滴度高于同等滅活抗原10倍以上，比自然感染抗體還高[13]。

7 結(jié)束語

佐劑自應(yīng)用以來，在組成和類別上不斷增加，對(duì)預(yù)防接種起到了至關(guān)重要的作用。佐劑的應(yīng)用減少了疫苗的接種劑量，并且減少了過量疫苗接種而引起的不良反應(yīng)。但是，由于有些佐劑本身具有一定毒性、致敏性、致炎性，大大制約了佐劑在人體的應(yīng)用，因此，安全問題是目前佐劑使用的瓶頸。如何突破這個(gè)瓶頸，開發(fā)出安全、有效、便捷的佐劑，是未來佐劑研發(fā)工作的核心任務(wù)。相信隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新型的安全的佐劑將很快被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，不斷地造福人類。

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1673-5846(2014)09-0213-03

1大慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病原生物與免疫學(xué)教研，黑龍江大慶 163000

2大慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校過敏病醫(yī)院，黑龍江大慶 163000