HPLC一測多評法用于木香及3種含木香中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量評價Δ

楊 憲，劉筱琴，張 雪，楊水平，余曉東，和七一，趙 瑛（.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶033；.重慶化工職業(yè)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，重慶 0000；3.重慶市中藥研究院，重慶 00065；.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 0076）

HPLC一測多評法用于木香及3種含木香中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量評價Δ

楊 憲1＊，劉筱琴2，張 雪3#，楊水平4，余曉東1，和七一1，趙 瑛1（1.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶401331；2.重慶化工職業(yè)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，重慶 400020；3.重慶市中藥研究院，重慶 400065；4.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400716）

目的：建立測定木香及3種含木香的中藥復(fù)方制劑中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量的方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）一測多評法，選取木香烴內(nèi)酯作為內(nèi)參物，建立該成分與去氫木香內(nèi)酯的相對校正因子（f），從而對木香及3種含木香的中藥復(fù)方制劑中的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯進(jìn)行含量測定。結(jié)果：木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的進(jìn)樣量分別在0.101 2～3.036 0μg（r＝0.999 8）和0.101 8～3.084 0μg（r＝0.999 9）范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系；f＝1.077 7，用木香烴內(nèi)酯加f測得去氫木香內(nèi)酯的加樣回收率為99.53%，RSD＝1.11%（n＝9）。結(jié)論：該試驗首次采用HPLC一測多評法測定了木香和3種含木香的中藥復(fù)方制劑中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量，方法準(zhǔn)確、可行。

一測多評法；校正因子；木香烴內(nèi)酯；去氫木香內(nèi)酯；木香；中藥復(fù)方制劑；含量測定

＊高級工程師，博士。研究方向：中藥新藥及保健食品開發(fā)。E-mail：yyxdsp@163.com

#通信作者：副研究員，碩士。研究方向：藥用植物栽培技術(shù)。E-mail：zhangxue0012003@163.com

木香及3種含木香的中藥復(fù)方，包括六味木香散（由木香、梔子、鬧羊花等6味中藥組成）、麻仁潤腸丸[由火麻仁、苦杏仁（去皮炒）、大黃、木香等6味中藥組成）、五味麝香丸[由麝香、訶子（去核）、黑草烏、木香、藏菖蒲5味藥材組成]，在2010年版《中國藥典》（一部）中均有收載。上述3種復(fù)方均具有行氣導(dǎo)滯、瀉熱通便之功效，適用于濕熱內(nèi)停、赤白痢疾、大便不通等證，廣泛用于治療各種腸胃疾病[1-4]，因而全國有數(shù)百家制藥廠均在生產(chǎn)，是市場流通量較大的中成藥之一。但是，目前對這些復(fù)方的質(zhì)量控制較弱，導(dǎo)致了在產(chǎn)品質(zhì)量方面的一些問題。鑒于此，本研究首次運用“一測多評”的思路，以木香烴內(nèi)酯加校正因子，采用高效液相色譜（HPLC）法對木香及3種含木香的中藥復(fù)方同時測定其中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量，并對該方法在中藥質(zhì)量控制中的可靠性進(jìn)行了驗證。

1 “一測多評”的原理

“一測多評”的原理如下：在線性范圍內(nèi)某成分的質(zhì)量或者濃度與檢測器響應(yīng)成正比，即：W＝fA，在多指標(biāo)質(zhì)量評價時，以某藥材中有對照品供應(yīng)的一典型成分為內(nèi)參物，建立該成分與其他成分之間的相對校正因子（f），進(jìn)而通過f計算其他成分的含量。這種通過測定其中一個成分，實現(xiàn)對多個成分定量的方法稱為“一測多評”[3-5]。

假設(shè)某樣品中含有i個成分，則：

式中，Wi為成分濃度；Ai為成分峰面積。選取其中之一的成分k為內(nèi)參物，建立成分k與其他成分m之間的f，則：

式（2）中，Ak為內(nèi)參物峰面積；Wk為內(nèi)參物濃度；Am為其他成分m的峰面積；Wm為其他成分m的濃度。

2材料

2.1 儀器

LC-2010A型HPLC儀（日本島津公司）、2690-2487型HPLC儀（美國Waters公司）、1200型HPLC儀（美國Agilent公司），均包括脫氣機、自動進(jìn)樣器、柱溫箱；AE163型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-1000型超聲波處理器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2.2 藥品與試劑

六味木香散、麻仁潤腸丸、五味麝香丸（購自重慶桐君閣大藥房，批號分別為20120801、130201、130102）；木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對照品（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品信息中心，批號分別為553-21-9、477-43-0，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

圖1 木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式A.木香烴內(nèi)酯；B.去氫木香內(nèi)酯Fig 1 Chem ical structures of costunolide and dehydrocostus lactoneA.costunolide；B.dehydrocostus lactone

2.3 藥材

木香藥材分別于不同時間采自重慶開縣、云南麗江、陜西西安、湖北利川、湖南益陽、廣東廣州、廣西南寧、四川雅安，均經(jīng)重慶中藥研究院張雪副研究員鑒定為真品。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

參照2010年版《中國藥典》（一部）木香項下色譜條件[2]：流動相為甲醇-水（65∶35，V/V），流速為1.0 m l/min，柱溫為30Ⅱ，進(jìn)樣量為10μl，檢測波長為225 nm。結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯色譜峰的峰形尖銳、對稱性好；供試品中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的色譜峰對稱性好，與前后其他峰的分離度均＞1.5，達(dá)到了基線分離。色譜見圖2。

3.2 溶液的制備

3.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒質(zhì)量的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對照品適量，加甲醇制成每1m l含木香烴內(nèi)酯0.506mg、去氫木香內(nèi)酯0.514mg的溶液，作為兩種單一成分的對照品貯備液。精密吸取兩種對照品貯備液各2m l，置于同一10m l量瓶中，加甲醇定容，即得混合對照品溶液。

圖2 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.木香藥材；1.木香烴內(nèi)酯；2.去氫木香內(nèi)酯Fig 2 HPLC chromatogram sA.m ixed control；B.Aucklandia lappa samples；1.Costunolide；2.Dehydrocostus lactone；

3.2.2 木香藥材溶液的制備 取木香粉末（過四號篩）約0.30 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50m l，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，放置過夜，超聲處理（功率：250W，頻率：50 kHz）30min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2.3 各中藥復(fù)方溶液的制備 （1）六味木香散供試品溶液：取本品粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50m l，稱定質(zhì)量并放置過夜，超聲處理（功率：250W，頻率：50 kHz）30m in后取出，放冷后再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。（2）麻仁潤腸丸供試品溶液：取本品研細(xì)的細(xì)粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50m l，密塞，稱定質(zhì)量并放置過夜，超聲處理（功率：250W，頻率：50 kHz）30m in后取出，放冷后再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。（3）五味麝香丸供試品溶液：取粉碎后的本品1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入氯仿25m l，密塞，稱定質(zhì)量并放置過夜，超聲處理（功率：250W，頻率：50 kHz）30min后取出，放冷后再稱定質(zhì)量，用氯仿補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5m l，置蒸發(fā)皿中揮干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5m l量瓶中，即得。

3.3 f的測定方法

取木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對照品溶液各適量，按“3.1”項下色譜條件用自動進(jìn)樣器分別進(jìn)樣30、20、10、5、2、1 μl，按公式（1），以木香烴內(nèi)酯為內(nèi)參物，計算去氫木香內(nèi)酯的f值。

3.4 f測定方法的耐用性研究

3.4.1 儀器的檢測波長λ對f的影響 HPLC儀紫外檢測器的λ存在偏差，且λ示值誤差為±2 nm，因此筆者分別在229、227、225、223、221 nm波長處測定并計算去氫木香內(nèi)酯的f，考察λ的變化對f的影響，詳見表1。

表1 儀器λ的變化對f的影響Tab 1 Effectsof the changesof detection wavelength on correction factor（f）

表1結(jié)果表明，在同一臺HPLC儀上，λ在已確定波長處變化為±2 nm或±4 nm，對木香烴內(nèi)酯計算所得去氫木香內(nèi)酯的f影響不大，RSD＝0.79%（n＝5）。

3.4.2 儀器流速對f的影響 HPLC儀的流速也可能有偏差，在使用同一臺HPLC儀時，檢定誤差應(yīng)為±2%，因此筆者分別在流速為0.98、1.00、1.02m l/min時測定并計算去氫木香內(nèi)酯的f，考察流速變化0.02m l/m in對f的影響。進(jìn)一步擴大試驗，計算0.80、1.20m l/min流速下去氫木香內(nèi)酯的f，考察流速變化對f的影響，詳見表2。

表2 儀器流速變化對f的影響Tab 2 Effects of the changes of flow rate on correction factor（f）

表2結(jié)果表明，在同一臺HPLC儀上，流速變化對木香烴內(nèi)酯計算所得去氫木香內(nèi)酯的f影響不大，RSD＝1.05%（n＝5）。

3.4.3 HPLC柱溫對f的影響 HPLC儀的柱溫箱也是有偏差的。《藥品檢驗儀器檢定規(guī)程》中規(guī)定環(huán)境溫度在10～30Ⅱ內(nèi)，8 h內(nèi)的溫度波動為±3Ⅱ，HPLC儀柱溫箱的誤差是±0.1Ⅱ，因此筆者采用同一臺HPLC儀，分別在33.0、30.1、30.0、29.9、27.0Ⅱ測定并計算去氫木香內(nèi)酯的f，考察HPLC柱溫變化對f的影響，詳見表3。

表3 HPLC柱溫變化對f的影響Tab 3 Effects of the changes of colum n tem perature on correction factor（f）

表3結(jié)果表明，在同一臺HPLC儀上，柱溫變化對木香烴內(nèi)酯計算所得去氫木香內(nèi)酯的f影響不大，RSD＝0.39%（n＝5）。

3.4.4 流動相比例對f的影響 HPLC儀的流動相比例也會對對照品的f造成影響，因此筆者使用同一臺HPLC儀，選擇流動相甲醇-水的比例分別為55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25（V/V）時測定并計算去氫木香內(nèi)酯的f，考察流動相比例對f的影響，詳見表4。

表4 流動相比例對f的影響Tab 4 Effects of the composition proportion of mobile phaseon correction factor（f）

表4結(jié)果表明，在同一臺HPLC儀上，流動相比例變化對木香烴內(nèi)酯計算所得去氫木香內(nèi)酯的f影響不大，RSD＝1.04%（n＝5）。

3.4.5 同規(guī)格不同品牌HPLC柱對f的影響 HPLC儀在定量測定時會使用不同品牌的液相色譜柱，筆者采用同一臺HPLC儀，使用5支同規(guī)格不同品牌的液相色譜柱（C18，250mm×4.6 mm，5μm）測定并計算去氫木香內(nèi)酯的f，考察同規(guī)格不同品牌的HPLC柱對f的影響，詳見表5。

表5 同規(guī)格不同品牌的HPLC柱對f的影響Tab 5 Effects of chromatographic columnsw ith same specification from differentbrandson correction factor（f）

表5結(jié)果表明，在同一臺HPLC儀上更換液相色譜柱，對木香烴內(nèi)酯計算所得去氫木香內(nèi)酯的f影響不大，RSD＝0.83%（n＝5）。

3.4.6 不同HPLC儀對f的影響 筆者采用島津ODS液相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），分別在3臺HPLC儀上測定并計算去氫木香內(nèi)酯的f，考察不同HPLC儀對f的影響，詳見表6。

表6 不同HPLC儀對f的影響Tab 6 Effects of different HPLC instrument on correction factor（f）

表6結(jié)果表明，HPLC儀的變化對木香烴內(nèi)酯計算所得去氫木香內(nèi)酯的f影響不大，SD＝0.94%（n＝3）。

根據(jù)“3.4.1”至“3.4.6”項下所得值計算平均值：f＝（1.079 0+ 1.074 3+1.079 3+1.077 0+1.075 3+1.081 3）/6＝1.077 7。

3.5 方法學(xué)考察

3.5.1 線性關(guān)系考察 按“3.2.1”項下方法制備對照品去氫木香內(nèi)酯和替代對照品木香烴內(nèi)酯溶液，在“3.1”項下色譜條件下，按“3.4”項下f測定方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明，木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯進(jìn)樣量分別在0.101 2～3.036 0、0.101 8～3.084 0 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。二者的回歸方程分別為y＝1×106x+4 496.4（r＝0.999 8，n＝6）、y＝1× 106x－8 791.8（r＝0.999 9，n＝6）。

3.5.2 精密度試驗 取“3.2.1”項下混合對照品溶液適量，在“3.1”項下色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的RSD分別為0.76%和1.25%（n均為6），表明儀器精密度良好。

3.5.3 重復(fù)性試驗 取同一批木香藥材粉末適量，按“3.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“3.1”項下色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的RSD分別為0.84%和1.13%（n均為6）。取同一批六味木香散樣品適量，按“3.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“3.1”項下色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的RSD分別為0.97%和1.21%（n均為6）。表明本方法重復(fù)性良好。

3.5.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批木香藥材供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、16 h在“3.1”項下色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的RSD分別為0.93%和 0.81%（n均為6），表明木香藥材供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取同一批六味木香散的供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、16 h在“3.1”項下色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的RSD分別為0.76%和1.04%（n均為6），表明六味木香散的供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5.5 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批木香藥材樣品（重慶開縣產(chǎn)，木香烴內(nèi)酯含量：18.36mg/g，去氫木香內(nèi)酯含量：25.81mg/g）9份，各約0.15 g，精密稱定，分別置于50m l錐形瓶中，每3份為一組，分別按80%、100%和120%的加入量精密加入木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對照品溶液，照“3.2.2”項下方法制備供試品溶液。按擬定方法，各精密吸取10μl注入HPLC儀，在“3.1”項下色譜條件下測定，計算加樣回收率，結(jié)果分別見表7、表8。再采用木香烴內(nèi)酯加f的方法對去氫木香內(nèi)酯進(jìn)行含量測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表9。

表7 木香烴內(nèi)酯的加樣回收率（n＝9）Tab 7 Recovery ratesof costunolide（n＝9）

表8 用去氫木香內(nèi)酯對照品按外標(biāo)法直接測定的回收率（n＝9）Tab 8 Recovery rates of dehydrocostus lactone according to internalstandard（n＝9）

表9 用木香烴內(nèi)酯加f測得去氫木香內(nèi)酯的回收率（n＝9）Tab 9 Recovery rates of dehydrocostus lactone according to costunolideand f（n＝9）

3.6 樣品含量測定

3.6.1 木香藥材的含量測定 取8批木香藥材各適量，分別按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液，再取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對照品溶液適量，在“3.1”項下色譜條件下進(jìn)樣測定，計算各批木香藥材中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量。另外，根據(jù)f由木香烴內(nèi)酯含量推算出各批木香藥材中去氫木香內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表10。

表10 木香藥材中各成分的含量（mg/g，n＝3）Tab 10 Contentsof each com ponent in A.lappa（m g/g，n＝3）

3.6.2 各中藥復(fù)方的含量測定 取各中藥復(fù)方適量，分別按“3.2.3”項下方法制備供試品溶液，再取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對照品溶液適量，在“3.1”項下色譜條件下進(jìn)樣測定，計算3種中藥復(fù)方中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量。另外，根據(jù)f由木香烴內(nèi)酯含量推算出3種中藥復(fù)方中去氫木香內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表11。

表11 中藥復(fù)方制劑中各成分的含量（mg/g，n＝3）Tab 11 Contents of each com ponent in TCM com pound preparations（mg/g，n＝3）

表10、表11結(jié)果表明，對木香藥材及3種含木香的中藥復(fù)方，通過常規(guī)外標(biāo)法實測含量與“一測多評”法計算所得含量沒有明顯差異。

4 討論

本研究選用木香烴內(nèi)酯為內(nèi)參物，建立該成分與去氫木香內(nèi)酯的f，并對HPLC儀的λ、流速、柱溫、流動相比例和同規(guī)格不同品牌的液相色譜柱，以及不同的HPLC儀進(jìn)行考察，結(jié)果表明本方法簡單、可行，可應(yīng)用于木香及含木香的中藥復(fù)方的多指標(biāo)成分含量測定。用“一測多評”法所得木香藥材及含木香的中藥復(fù)方中各成分含量與常規(guī)外標(biāo)法所測含量沒有明顯差異，說明在去氫木香內(nèi)酯對照品缺乏的情況下，可通過“一測多評”法實現(xiàn)多成分的同步含量測定[6-9]。

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Quality Evaluation ofAucklandia lappaand 3 TCM Com pound Preparations ContainingA.lappaby HPLC M ulti-com ponentsQuantitation by OneM arker

YANG Xian1，LIU Xiao-qin2，ZHANG Xue3，YANG Shui-ping4，YU Xiao-dong1，HE Qi-yi1，ZHAO Ying1（1.College of Life Science，Chongqing Normal University，Chongqing 401331，China；2.Dept.of Applied Chemistry，Chongqing Chem ical Industry Vocational College，Chongqing 400020，China；3.Chongqing Academy of TCM，Chongqing 400065，China；4.College of Resources and Environment，Southwest University，Chongqing 400716，China）

OBJECTIVE：To established a method for the content determ ination of costunolide and dehydrocostus lactone inAucklandia lappaand 3 TCM compound preparations containingA.lappa.METHODS：The contents of costunolide and dehydrocostus lactone inA.lappaand 3 TCM compound preparations containingA.lappawere determined by HPLC multi-components quantitation by one marker，using costunolide as internal standard and the correction factor（f）of costunolide to dehydrocostus lactone. RESULTS：The linear ranges of costunolide and dehydrocostus lactone were 0.101 2-3.036 0μg（r＝0.999 8）and 0.205 6-6.168 0 μg（r＝0.999 9）；thefof costunolide was 1.077 7，and average recovery of dehydrocostus lactone was 99.53%（RSD＝1.11%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The quantitativemethod using onemarker for simultaneous assay is feasible and applied for quality control ofA.lappaand 3 TCM compound preparations containingA.lappa.

Multi-components quantitation by one marker；Correction factor；Costunolide；Dehydrocostus lactone；Aucklandia.lappa；TCM compound preparation；Content determ ination

R284.1；R283；R917

A

1001-0408（2014）11-1030-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.11.25

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目（No.KJ130618）；重慶師范大學(xué)校級基金項目（No.12XLB028）

2013-10-31

2014-01-04）