苦參生物堿類成分的HPLC指紋圖譜研究

易遠(yuǎn)紅，郝月莆（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部，成都 61007；.成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137）

苦參生物堿類成分的HPLC指紋圖譜研究

易遠(yuǎn)紅1＊，郝月莆2（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部，成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137）

目的：建立苦參生物堿類成分的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：色譜柱為KromasilNH2（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-乙醇（8∶1，V/V）-3%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1m l/m in，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；采用《中藥色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）對(duì)3批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：建立的HPLC指紋圖譜中，苦參生物堿類成分各峰分離度較好，一共確定了17個(gè)共有峰，并對(duì)其中5個(gè)峰進(jìn)行了定位指認(rèn)；3批樣品的相似度均＞0.9。結(jié)論：該方法可得到精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性較好的苦參生物堿類成分的HPLC指紋圖譜，為苦參提取物的質(zhì)量控制提供另一種檢測(cè)方法。

苦參；生物堿；指紋圖譜；高效液相色譜法

苦參（Sophora flavescensAit.）為豆科槐屬植物苦參的干燥根，全國(guó)各地均有出產(chǎn)，是我國(guó)常用中藥?？鄥⒕哂星鍩嵩餄?、瀉火解毒、祛風(fēng)止癢的功效，同時(shí)還具有抗腫瘤[1-2]、抑菌[3]等作用，其主要含有生物堿類、黃酮類和皂苷類成分，發(fā)揮療效的是生物堿類成分。苦參生物堿大多為喹諾里西啶類結(jié)構(gòu)，堿性較強(qiáng)，酸性流動(dòng)相條件下，它在C18柱色譜峰拖尾嚴(yán)重[4]。目前尚未發(fā)現(xiàn)采用正相柱對(duì)生物堿類成分進(jìn)行指紋圖譜的系統(tǒng)研究。本研究采用氨基柱為分離柱，以乙腈-乙醇（8∶1，V/V）為有機(jī)相，3%磷酸水溶液為水相，梯度洗脫，測(cè)定苦參生物堿類指紋圖譜，以為苦參生物堿類指紋圖譜的測(cè)定提供另一種檢測(cè)方法。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜（HPLC）儀，包括四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣針、恒溫柱箱、DAD二極管陣列檢測(cè)器、Agilent化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；BS224S型十萬(wàn)分之一型電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試劑

AB-8大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自南開(kāi)大學(xué)化工廠；苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿對(duì)照品（批號(hào)分別為110805-200508、110780-201007、110783-200115、110779-201046、110784-20303）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、磷酸為分析純，乙腈、乙醇為色譜純，水為雙蒸水。

1.3 藥材

苦參藥材（批號(hào)：101003）購(gòu)自四川科倫天然藥業(yè)有限公司，經(jīng)筆者鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 試液的制備

2.1.1 苦參生物堿的提取 參照文獻(xiàn)[5]，取苦參藥材粗粉適量，滲漉法制備樣品，以1 g/m l的適量濃度濃縮后，上樣于AB-8大孔吸附樹(shù)脂（徑高比1∶3），用1.5倍體積水洗除雜，再用6倍體積50%乙醇以每小時(shí)2倍體積的流速洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，即得生物堿類提取物。

2.1.2 供試品溶液的制備 取苦參生物堿類提取物，精密稱定0.100 2 g，溶于25m l無(wú)水乙醇中，超聲處理30min，濾過(guò)，定容至50m l容量瓶中，精密吸取1m l，定容至10m l容量瓶中，稀釋至刻度，即得供試品。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 取苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿，分別精密稱定0.011 20、0.01532、0.013 40、0.016 6、0.010 01 g，置于10m l容量瓶中，加乙腈-甲醇溶液（80∶20，V/V）至刻度，精密吸取1m l，置于10m l容量瓶中，稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液；將槐定堿和氧化苦參堿對(duì)照品等量混合，制得混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：正相柱KromasilNH2（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：有機(jī)相為乙腈-乙醇（8∶1，V/V），水相為3%磷酸水溶液，梯度洗脫（程序見(jiàn)表1）；流速：1m l/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣量：10μl；柱溫：30℃。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient dilution procedure

2.3 參照峰的選擇

將苦參堿對(duì)照品溶液和供試品溶液各進(jìn)樣10μl，對(duì)比圖譜中保留時(shí)間約為32min的色譜峰為苦參堿，因其色譜峰易于辨認(rèn)、與其他的峰分離良好，且峰形穩(wěn)定、保留時(shí)間適中，故采用此峰為參照峰。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取苦參生物堿類成分供試品溶液適量，按“2.1.2”項(xiàng)制備，連續(xù)進(jìn)樣6次，以苦參堿峰為標(biāo)準(zhǔn)峰，考察色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.15%，峰面積的RSD＜2.5%，表明精密度良好。2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.1”項(xiàng)下供試品溶液適量，從制備到放置0、2、4、8、16 h后，分別測(cè)定。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1.97%，峰面積的RSD＜5.0%，說(shuō)明生物堿類成分在室溫條件下16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取苦參生物堿類提取物適量，精密稱定0.1002、0.1003、0.1001、0.1003、0.1002、0.1005 g，共6份，按“2.1.2”項(xiàng)下操作法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1.3%，峰面積的RSD＜3.5%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 樣品指紋圖譜的測(cè)定 分別取3個(gè)批次的苦參生物堿類提取物適量，按“2.1.1”項(xiàng)下操作法制備供試品溶液，在HPLC色譜儀中按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄60m in HPLC色譜峰，以峰出現(xiàn)率100%計(jì)，確定17個(gè)共有峰。色譜見(jiàn)圖1。

2.5.2 共有峰的標(biāo)定與確認(rèn) 將3批苦參提取物的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)開(kāi)發(fā)的《中藥色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）[6]，設(shè)定匹配模板，進(jìn)行譜峰多點(diǎn)校正，并生成對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖2。確定比較穩(wěn)定的共有峰17個(gè)，3批的相似度均＞0.9，平均值為0.997，表明所建立的指紋圖譜技術(shù)指標(biāo)穩(wěn)定，重復(fù)性好，見(jiàn)表2。2.5.3 主要色譜峰的指認(rèn) 根據(jù)同一化合物相同色譜分離條件下保留時(shí)間相同，紫外光譜圖一致的原則，分別指認(rèn)出5個(gè)色譜峰，分別是12號(hào)峰（槐果堿）、13號(hào)峰（苦參堿）、14號(hào)峰（氧化槐果堿）、15號(hào)峰（槐定堿）和16號(hào)峰（氧化苦參堿）?；倍▔A和氧化苦參堿的極性相似，保留時(shí)間差異不大，故將槐定堿和氧化苦參堿混勻測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram s

圖2 3批苦參生物堿類成分的HPLC指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprints of 3 batches of alkaloids from S. flavescens

表2 3批樣品指紋圖譜中共有峰的保留時(shí)間和峰面積Tab 2 The retention time and peak area of the fingerprints of 3 batchesof samp les

圖3 對(duì)照品的HPLC圖S1.苦參堿對(duì)照品；S2.槐定堿與氧化苦參堿的混合對(duì)照品；S3.槐果堿對(duì)照品；S4.氧化槐果堿對(duì)照品Fig 3 HPLC chromatogramsof substance controlS1.matrine control；S2.m ixed control of sophoridine and oxymartrine；S3.sophocarpine control；S4.oxysophocarpine control

3 討論

黃穎等[7]在對(duì)山豆根生物堿的指紋圖譜研究中發(fā)現(xiàn)，采用C18柱色譜峰易拖尾，加大磷酸和三乙胺的濃度可以使峰形減少拖尾；但隨著加入濃度的升高，對(duì)儀器和色譜柱的損害也在增大[8]。趙華等[9]在對(duì)苦參藥材生物堿成分的指紋圖譜研究中發(fā)現(xiàn)，苦參生物堿堿性較強(qiáng)，酸性流動(dòng)相條件下，它們?cè)贑18柱上的色譜峰拖尾嚴(yán)重。在水相中添加氨水可顯著抑制峰拖尾，同時(shí)可提高保留強(qiáng)度?？梢?jiàn)，使用C18柱對(duì)生物堿的指紋圖譜研究都存在色譜峰的拖尾問(wèn)題，而且在流動(dòng)相中到底是加酸還是加堿能夠較有效地抑制拖尾等問(wèn)題也有待研究。

按照上述實(shí)驗(yàn)條件對(duì)購(gòu)買(mǎi)的苦參生物堿類成份進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)苦參生物堿類成分的色譜峰都集中在25～40min之間，各色譜峰之間分離度較好，也證明了生物堿極性都較大，如果采用C18柱梯度洗脫分離，生物堿類成分都較集中出現(xiàn)在前半段，對(duì)色譜峰的分離效果較差。

通過(guò)查閱文獻(xiàn)，未見(jiàn)采用氨基柱測(cè)定生物堿類指紋圖譜的報(bào)道，故本研究擬在解決C18柱拖尾問(wèn)題的同時(shí)，也為生物堿類成分的指紋圖譜研究提供另一種方法，故只對(duì)3批苦參生物堿類成分進(jìn)行了指紋圖譜的研究，以后需要增進(jìn)10批苦參生物堿類成分進(jìn)行系統(tǒng)的指紋圖譜考察。

[1] 張力，李海英，吳式琇，等.苦參堿對(duì)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的抑制作用研究[J].江西中醫(yī)藥，2009，21（6）：75.

[2] 徐廣偉，滿世軍，王志生，等.氧化苦參堿對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)腫瘤臨床與康復(fù)，2001，8（5）：10.

[3] 蔣蓮芳，蔣亞生.苦參藥理研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000，11（3）：278.

[4] 趙華，宋敏，趙畫(huà)，等.苦參藥材生物堿成分的HPLC指紋圖譜[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（2）：139.

[5] 王瑩，向?qū)O敏，王淼，等.苦參生物總堿純化工藝研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（7）：1 634.

[6] 劉文，蔣世云.中藥指紋圖譜研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2011，22（19）：1 819.

[7] 黃穎，王乃平，陳勇.廣西產(chǎn)山豆根HPLC指紋圖譜測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（14）：66.

[8] 宋潔瑾，陳濤，李進(jìn).梯度洗脫方法在中藥指紋圖譜中的應(yīng)用[J].天津藥學(xué)，2007，19（6）：70.

[9] 趙華，宋敏，趙畫(huà)，等.苦參藥材生物堿成分的HPLC指紋圖譜[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（2）：139.

Study on HPLC FingerprintsofA lkaloids fromSophora flavescens

YI Yuan-hong1，HAO Yue-pu2（1.Dept.of Pharmacy，The Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM，Chengdu 610072，China；2.Key Lab for Systematic Study and Utilization of TCM Source，Chengdu University of TCM，M inistry of Education，Chengdu 611137，China）

OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint of alkaloids fromSophora flavescens.METHODS：The determ ination was performed on Kromasil NH2（250×4.6 mm，5μm）column w ith mobile phase consisted of acetonitrile-ethanol（8∶1，V/V）-3% phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1 m l/m in.The detection wavelength was set at 220 nm.The sim ilarity of 3 batches of samples was evaluated by usingTCM Chromatographic Fingerprint Evaluation System（2004 A edition）.RESULTS：In HPLC fingerprints，the chromatographic peaks of alkaloids fromS.flavescenswere well-separated，and there were 17 common peaks，among which 5 peaks were positioned and identified.The sim ilarity of 3 batches was more than 0.9.CONCLUSIONS：HPLC fingerprint of alkaloids fromS.flavescenscan be obtained w ith good precision，reproducibility and stability，providing another detectionmethod for quality control of alkaloids fromS.flavescens.

Sophora flavescens；Alkaloid；Fingerprint；HPLC

R284.1；R917

A

1001-0408（2014）19-1772-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.19.14

＊主管藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、中藥學(xué)。E-mail：895239295 @qq.com

2013-12-09

2014-01-20）

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