高效液相色譜法測(cè)定注射用鹽酸瑞芬太尼有關(guān)物質(zhì)

楊 爭(zhēng),戎曉娟,曹俊涵,馬玉潔,李詩草,楊 紅

（1.中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052；2.成都市食品藥品檢測(cè)中心，四川 成都 610045）

高效液相色譜法測(cè)定注射用鹽酸瑞芬太尼有關(guān)物質(zhì)

楊 爭(zhēng)1,戎曉娟1,曹俊涵2,馬玉潔1,李詩草1,楊 紅1

（1.中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052；2.成都市食品藥品檢測(cè)中心，四川 成都 610045）

建立高效液相色譜法測(cè)定注射用鹽酸瑞芬太尼的有關(guān)物質(zhì)，色譜柱采用Kromasil氰基柱，流動(dòng)相為0.03mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.0）-甲醇-乙腈（80∶16∶4），檢測(cè)波長(zhǎng)225nm。鹽酸瑞芬太尼在0.5046～1009.2μg/mL范圍內(nèi)與雜質(zhì)峰面積顯示有良好的線性關(guān)系（r=0.9999），最低檢出限為0.001μg。該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可用于注射用鹽酸瑞分太尼有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。

鹽酸瑞芬太尼；高效液相色譜；測(cè)定

0 引 言

鹽酸瑞芬太尼（remifentanil hydrochloride）是一種由酯酶代謝的強(qiáng)效阿片受體激動(dòng)劑，其作用起效迅速且極快消失，給藥劑量小，半衰期短，已逐漸成為鎮(zhèn)痛性麻醉藥市場(chǎng)上銷售份額最大的品種。目前，鹽酸瑞芬太尼及注射用鹽酸瑞芬太尼尚未被國(guó)內(nèi)外藥典收載，國(guó)內(nèi)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)有收載[1]，但有關(guān)物質(zhì)的分析方法文獻(xiàn)未見報(bào)道。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道大多是有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)方面研究測(cè)定生物樣品中鹽酸瑞芬太尼的HPLC方法[2-5]，由于原國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中注射用鹽酸瑞芬太尼有關(guān)物質(zhì)檢查方法主峰保留較小，各峰之間分離度差，本文經(jīng)研究改進(jìn)建立的HPLC法測(cè)定注射用鹽酸瑞芬太尼的有關(guān)物質(zhì)，分離度高，準(zhǔn)確性好，能很好地用于控制本品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

LC-20AB型高效液相色譜儀，包括LC-20AB型泵，SPD-20A型紫外檢測(cè)器，SIL-20AC型自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-solution色譜工作站（日本島津）。

鹽酸瑞芬太尼對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，105℃干燥2 h后使用，含量100.0%，批號(hào)171260-200601）。注射用鹽酸瑞芬太尼（四川抗菌素工業(yè)研究所制備），規(guī)格1mg。甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

供試品溶液：取本品，加流動(dòng)相稀釋制成每1mL中約含0.5mg的溶液，作為供試品溶液。

對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液適量，加流動(dòng)相制成每1mL中約含10.0μg的溶液，作為對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件與測(cè)定法

色譜柱Kromisil氰基柱（4.6mm×250mm×5μm）；流動(dòng)相0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液（以磷酸調(diào)至pH 3.0）-甲醇-乙腈（80∶16∶4）；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；流速1.0mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。取瑞芬太尼對(duì)照品5mg，置10mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，取此溶液2mL，加2滴0.5mol/L氫氧化鈉溶液，在25℃放置10min后，加2滴0.5mol/L鹽酸溶液中和，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。理論板數(shù)按瑞芬太尼峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；主要色譜峰的出峰順序?yàn)殡s質(zhì)A、瑞芬太尼。瑞芬太尼峰與雜質(zhì)A峰（相對(duì)保留時(shí)間約為0.82～0.88的）的分離度應(yīng)大于3.0。

測(cè)定法。取本品，加流動(dòng)相稀釋制成每1mL中約含0.5mg的溶液，作為供試品溶液；再精密量取適量，加流動(dòng)相制成每1mL中約含10.0μg的溶液，作為對(duì)照溶液；取對(duì)照溶液20 μL，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分峰的峰高約為滿量程的20%。精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，除輔料峰外，單個(gè)雜質(zhì)峰的峰面積不得大于對(duì)照溶液的主峰面積（2.0%），各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的2.5倍（5.0%）。

2.3 專屬性試驗(yàn)

2.3.1 空白輔料分離試驗(yàn)

取本品及空白輔料，照2.2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，空白輔料峰與主峰完全分離，輔料不干擾測(cè)定，其結(jié)果見圖1、圖2。

2.3.2 強(qiáng)烈因素破壞試驗(yàn)

取注射用鹽酸瑞芬太尼1mg規(guī)格一瓶，分別進(jìn)行高溫、酸、堿和氧化破壞，然后按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液配制方法處理，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見圖3，在相對(duì)保留時(shí)間為0.86處有一主要降解雜質(zhì)（簡(jiǎn)稱A），主峰與降解雜質(zhì)峰能達(dá)到有效分離，樣品對(duì)強(qiáng)光破壞較穩(wěn)定，未見明顯雜質(zhì)增加。

2.4 線性試驗(yàn)

運(yùn)用熱破壞樣品進(jìn)行線性關(guān)系試驗(yàn)，選用高溫破壞的注射用鹽酸瑞芬太尼樣品考察雜質(zhì)峰面積（雜質(zhì)A，相對(duì)保留時(shí)間為0.86）與進(jìn)樣濃度之間的線性關(guān)系。取熱破壞樣品適量置于容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成0.5046，5.046，25.23，50.46，100.92，252.3，302.3，403.7，504.6，605.5，807.4，1 009.2 μg/mL系列溶液，進(jìn)樣體積20 μL，記錄色譜圖。以圖3中峰3的面積A對(duì)供試品濃度C（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A=525262C-1090.7。供試液濃度在0.5046～1 009.2 μg/mL范圍內(nèi)與雜質(zhì)A的峰面積顯示有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9999。

2.5 檢出限

將注射用鹽酸瑞芬太尼有關(guān)物質(zhì)檢查濃度為0.5mg/mL時(shí)，有關(guān)物質(zhì)（和降解產(chǎn)物）可檢出的最低含量為0.01%，最小檢出量（進(jìn)樣體積20 μL計(jì)算）為0.001μg。

2.6 精密度

2%自身對(duì)照溶液重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取本品，加流動(dòng)相制成每1mL中約含10.0μg的溶液，制成2%對(duì)照溶液；取此溶液，分別進(jìn)樣6次，按主峰面積計(jì)算對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣的RSD為0.26%，方法的重復(fù)性符合要求，且2%對(duì)照溶液的峰面積在6℃放置19h后測(cè)定，主峰面積無明顯變化，說明樣品溶液可穩(wěn)定19h。

對(duì)同一批號(hào)樣品不同日期稱量，不同儀器，不同操作人員按有關(guān)物質(zhì)檢查方法測(cè)定，進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)，結(jié)果見表1，由于雜質(zhì)含量很低，所以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，但檢查方法的精密度能滿足本品有關(guān)物質(zhì)限度檢查的要求。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性

將供試品溶液在25℃下放置，分別于0，0.5，1，2，3，4，6h取樣，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果在放置6h時(shí)，主要單個(gè)雜質(zhì)峰面積增大近2倍，說明測(cè)定時(shí)供試品溶液較不穩(wěn)定，宜臨時(shí)新配。

取注射用鹽酸瑞芬太尼，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，結(jié)果見表2，說明樣品中存在雜質(zhì)含量低，純度高，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 討 論

3.1 流動(dòng)相配比選擇

甲醇、乙腈分別單獨(dú)與磷酸鹽緩沖液配比，以及這兩種有機(jī)溶劑混合與磷酸鹽緩沖液組成的流動(dòng)相，進(jìn)行樣品的HPLC雜質(zhì)分析，綜合比較發(fā)現(xiàn)兩種有機(jī)溶劑混合的分離效果更好。對(duì)不同比例有機(jī)溶劑配比進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明有機(jī)溶劑比例偏大導(dǎo)致主峰前的兩個(gè)雜質(zhì)峰重疊，不能分離。

3.2 流動(dòng)相緩沖溶液pH的選擇

考察流動(dòng)相在pH為2.5，3.0，4.0，5.0，6.5時(shí)，主峰與雜質(zhì)峰的分離結(jié)果表明，pH 6.5流動(dòng)相配制的供試品溶液不穩(wěn)定；pH 5.0時(shí)主峰分叉不對(duì)稱；pH

2.5和pH 3.0時(shí)分離的雜質(zhì)峰順序、個(gè)數(shù)、大小都基本一致。綜合考慮，選擇pH 3.0。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選定及主峰純度考察

智慧鄉(xiāng)村是農(nóng)業(yè)、農(nóng)村智能化建設(shè)的重要路徑之一，代表著我國(guó)鄉(xiāng)村未來發(fā)展的新方向。智慧鄉(xiāng)村作為一種新興的概念體，是以現(xiàn)代化的互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)為依托，提高農(nóng)村地區(qū)生產(chǎn)力水平，改善人地關(guān)系，以提高農(nóng)民的生活水平和建立智能化文化、產(chǎn)業(yè)價(jià)值體系為目標(biāo)，打造以休閑旅游、文化體驗(yàn)、農(nóng)耕養(yǎng)殖等多種生產(chǎn)生活方式的新農(nóng)村，使農(nóng)村地區(qū)的生產(chǎn)生活方式處于“智慧”的狀態(tài)。智慧鄉(xiāng)村的建設(shè)已成為廣大農(nóng)村地區(qū)干部群眾的迫切需求和期待，將在鄉(xiāng)村發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

將高溫破壞樣品在200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行DAD二極管陣列紫外掃描檢測(cè)，結(jié)果表明主成分與雜質(zhì)A的末端吸收較大，在210～235nm范圍都有相似的紫外吸收譜。樣品主峰的純度因子為999.960。

樣品在波長(zhǎng)215，220，225和230nm處測(cè)定的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定峰個(gè)數(shù)相差不大，考慮215nm低波長(zhǎng)處溶劑峰干擾較大，因此測(cè)定波長(zhǎng)選225nm為宜。

3.4 注射用鹽酸瑞芬太尼的有關(guān)物質(zhì)定性

國(guó)外文獻(xiàn)[2-3]中有提到瑞芬太尼在體內(nèi)降解或代謝過程中形成去甲氧基化合物（GI90291）和N-脫烷基化合物（GI94219）。在注射用鹽酸瑞芬太尼的質(zhì)量及穩(wěn)定性研究中發(fā)現(xiàn)，樣品的HPLC譜圖顯示存在3個(gè)雜質(zhì)峰，有一主要雜質(zhì)峰（簡(jiǎn)稱雜質(zhì)A）相對(duì)保留時(shí)間為0.86，雜質(zhì)A與酸堿破壞產(chǎn)生的主要雜質(zhì)峰保留時(shí)間一致，是一個(gè)降解雜質(zhì)。為了確證雜質(zhì)A的結(jié)構(gòu)，通過堿降解破壞得到雜質(zhì)A，再經(jīng)分離純化后獲得純度大于98%（色譜純度）的雜質(zhì)A，進(jìn)行氫譜、碳譜確定為4-（甲氧基羰基）-4-[（1-氧代丙基）苯胺基]-1-哌啶丙酸[6]，即為文獻(xiàn)報(bào)道的去甲氧基化合物（GI90291）。

3.5 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定自身對(duì)照法確定

注射用鹽酸瑞芬太尼的主要單個(gè)雜質(zhì)為雜質(zhì)A，但雜質(zhì)A對(duì)照品無法購(gòu)買，經(jīng)制備獲取少量雜質(zhì)A，試驗(yàn)測(cè)出雜質(zhì)A相對(duì)校正因子為0.939。因此按2010年版中國(guó)藥典附錄XI X F藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則規(guī)定[7]，“已知雜質(zhì)或毒性雜質(zhì)對(duì)主成分的相對(duì)校正因子在0.9～1.1的范圍內(nèi)時(shí)，可以用主成分的自身對(duì)照法計(jì)算含量，超出0.9～1.1的范圍時(shí)，宜用對(duì)照品對(duì)照法計(jì)算含量”。又通過對(duì)雜質(zhì)對(duì)照品和自身對(duì)照法進(jìn)行樣品有關(guān)物質(zhì)檢查比較試驗(yàn)，其結(jié)果基本一致。在不影響測(cè)定結(jié)果的前提條件下，為避免制備雜質(zhì)對(duì)照品的繁瑣，使方法快速、簡(jiǎn)便，因此注射用鹽酸瑞芬太尼的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法選用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法[8-9]。

4 結(jié)束語

通過上述各項(xiàng)試驗(yàn)表明，經(jīng)色譜條件優(yōu)化的注射用鹽酸瑞芬太尼有關(guān)物質(zhì)HPLC檢查方法，對(duì)樣品存在的有關(guān)物質(zhì)和降解產(chǎn)物，以及與主成分之間各峰均有很好的分離度。記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍，足以完全檢查產(chǎn)品中可能存在的雜質(zhì)，有效改進(jìn)了原國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)注射用鹽酸瑞芬太尼有關(guān)物質(zhì)檢查方法雜質(zhì)之間分離較差的現(xiàn)象。本方法滿足中國(guó)藥典注射用鹽酸瑞芬太尼產(chǎn)品中雜質(zhì)（有關(guān)物質(zhì)和降解產(chǎn)物）檢查要求，對(duì)于更好地控制樣品中有關(guān)物質(zhì)具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，亦可作為本品穩(wěn)定性研究中降解產(chǎn)物含量變化測(cè)定的有效方法。

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Determination of related substances in remifentanil hydrochloride for injection by HPLC

YANG Zheng1，RONG Xiao-juan1，CAO Jun-han2，MA Yu-jie1，LI Shi-cao1，YANG Hong1
（1.Sichuan Industrial Institute of Antibiotics of China National Pharmaceutical Group Corporation，Chengdu 610052，China；2.Chengdu Center of Food and Drug Control，Chengdu 610045，China）

A HPLC method wasestablished forthe determination ofrelated substancesin remifentanil hydrochloride.A Kromisil-CN column was used，with the mobile phase of 0.03 mol/L potassium dihydrogen phosphate-methol-acetonitrile （80∶16∶4）and the detecting wavelength of 225 nm.The calibration curve was linear in the concentration range of 0.5046-1 009.2 μg/mL（r= 0.999 9）.And the limit of detection was 0.001 μg.The method is simple，accurate and specific，and it can be used for determining related substances in remifentanil hydrochloride for injection.

remifentanil hydrochloride；HPLC；determination

R971+.2；TQ460.7+2；O657.7+2；TQ463+.3

：A

：1674-5124（2014）04-0056-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.04.014

2013-07-17；

：2013-09-18

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（No2011ZX09401-403-8）

楊 爭(zhēng)（1965-），男，四川成都市人，工程師，主要從事藥物制劑和分析研究工作。