肺結(jié)核患者痰標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)方法分析

閆曉琳

肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌引起的肺部慢性傳染性疾病。結(jié)核菌屬分枝桿菌屬, 對(duì)人類致病主要是人型菌, 其次為牛型菌, 具有抗酸染色的特性。結(jié)核菌素試驗(yàn)是判斷機(jī)體是否感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌的主要手段, 結(jié)核菌素強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)提示機(jī)體處于結(jié)核超敏感狀態(tài)［1］。選取2012年6月～2013年6月60例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本進(jìn)行快速培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)提高結(jié)核分枝桿菌的檢出率。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 肺結(jié)核患者60例痰標(biāo)本均來(lái)自本院住院患者。其中男38例, 女22例, 年齡8～83歲, 平均34歲。

1.2 痰標(biāo)本前處理 ①酸處理法：用于堿性L-J培養(yǎng)基。取痰標(biāo)本數(shù)毫升, 根據(jù)黏稠度的不同, 加入2～4倍量的2%～4%H2SO4, 振蕩, 混勻, 放室溫處理20 min, 其間振蕩2～3次, 促進(jìn)液化。②堿處理法：用于酸性L-J培養(yǎng)基。取痰標(biāo)本數(shù)毫升, 根據(jù)黏稠度的不同, 加入2～4倍量2%～4%NaOH, 振蕩器振蕩5～10 min或置室溫30 min, 其間振蕩2～3次促進(jìn)液化。③胰蛋白酶、新潔爾滅法：痰標(biāo)本加入等量或倍量0.1%胰蛋白酶溶液, 振蕩至消化均勻, 加入半量以殺滅雜菌的0.3%新潔爾滅, 混勻放置室溫5 min。注意新潔爾滅與標(biāo)本接觸勿超過(guò)5 min。④NaOHNALC法：試劑配置：2.94%(0.1 mol/L)枸櫞酸鈉溶液50 ml, 加4%NaOH溶液50 ml, 混勻, 臨用前加入0.5 g NALC, 因該溶液不穩(wěn)定, 應(yīng)密閉冷藏且當(dāng)日內(nèi)使用。處理方法：取痰標(biāo)本1 ml放入50 ml離心管內(nèi), 加等量消化液, 振蕩混勻, 靜置20 min。加滅菌的濃度為0.067 mol/L的pH 6.8磷酸鹽緩沖液至50 ml刻度處混勻, 3000 r/min, 離心20 min, 棄去上清。

1.3 接種 將培養(yǎng)基置溫箱預(yù)溫30 min(羅氏培養(yǎng)基或其他固體結(jié)核培養(yǎng)基)。于無(wú)菌室內(nèi)用毛細(xì)管取標(biāo)本約0.1 ml, 接種于培養(yǎng)基斜面, 使其沿斜面鋪蓋。封嚴(yán)管口, 將試管平置, 使斜面呈水平位15～20 min, 移入37℃培養(yǎng), 如采用4%NaOH處理則應(yīng)用硫酸中和后接種。

1.4 結(jié)果觀察 培養(yǎng)基接種標(biāo)本以后, 每周由溫箱觀察1次, 有菌落生長(zhǎng)時(shí), 可報(bào)告。分枝桿菌培養(yǎng)陰性(-)斜面無(wú)菌生長(zhǎng), 分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性(+)菌落占斜面面積的1/4, 分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性(++)菌落占斜面面積的1/2, 分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性(+++)菌落占斜面面積的3/4, 分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性(++++)菌落布滿全斜面, 菌落占斜面面積不足1/4者實(shí)報(bào)菌落數(shù)。必要時(shí)做涂片染色, 生化鑒定、菌型鑒定、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。至第8周未生長(zhǎng)時(shí)可報(bào)告“培養(yǎng)8周無(wú)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)”。在觀察分枝桿菌生長(zhǎng)情況時(shí), 發(fā)現(xiàn)有非分枝桿菌的生長(zhǎng),報(bào)告污染, 重新送檢。

2 結(jié)果

痰涂片抗酸染色鏡檢, 陽(yáng)性23例, 陽(yáng)性率38.33%。

3 討論

分枝桿菌的培養(yǎng)和一般細(xì)菌不同, 營(yíng)養(yǎng)要求比較高, 如需要氧、碳、氮、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽類(磷、鉀、鎂、鐵等)、生長(zhǎng)素(煙酸、核黃素及來(lái)自卵黃、血液的某些成分)等。常用的培養(yǎng)基用氨基酸、甘油及無(wú)機(jī)鹽等成分配制基礎(chǔ)液, 再加雞蛋液混勻凝固而形成固體培養(yǎng)基。分枝桿菌培養(yǎng)的目的是增加分枝桿菌生長(zhǎng)率, 提高陽(yáng)性率, 為結(jié)核病的診斷提供最可靠的證據(jù)；活菌可用于藥物敏感性測(cè)定, 指導(dǎo)臨床藥物治療；活菌可用于菌種鑒定, 為結(jié)核病與非結(jié)核性分枝桿菌病鑒別診斷提供依據(jù)；活菌可用于毒力測(cè)定；用于流行病學(xué)調(diào)查, 明確傳染源, 確定預(yù)防措施［2］；某些通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)早期代謝物達(dá)到快速鑒定細(xì)菌目的的新方法仍屬培養(yǎng)范疇。

標(biāo)本前處理是利用分枝桿菌細(xì)胞壁的高脂質(zhì)成分具有較強(qiáng)抗酸、堿作用的特性, 在培養(yǎng)接種前將標(biāo)本用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿加以處理, 其目的是殺滅或抑制雜菌的生長(zhǎng), 溶解黏液、膿汁、蛋白, 將被包裹的分枝桿菌釋放出來(lái), 提高檢出率。

培養(yǎng)基一般放冰箱(2～8℃)避光保存。為了防止培養(yǎng)基失去凝固水, 可采用螺旋試管分裝培養(yǎng)基, 并將試管裝入塑料袋中封口保存。必要時(shí)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行抽樣生長(zhǎng)試驗(yàn), 接種標(biāo)準(zhǔn)菌株(H3TRy)10-3mg濕菌, 4周內(nèi)有菌落生長(zhǎng)者方可, 否則為質(zhì)量不合格。污染率應(yīng)控制在2%以下, 當(dāng)污染率高于2%時(shí), 提示培養(yǎng)基污染或消化處理不當(dāng)。應(yīng)采取相應(yīng)措施。

［1］ 劉志輝, 羅魯.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷現(xiàn)狀及展望.中國(guó)防癆雜志, 2003,25(3):38-40.

［2］ 張衛(wèi)紅, 石勝, 黃小霞, 等.綜合醫(yī)院與結(jié)核病防治所痰涂片抗酸桿菌檢出率比較.中國(guó)基層醫(yī)學(xué), 2004,11(6):700.