大承氣湯對不完全性腸梗阻大鼠血清中乙酰膽堿和一氧化氮及回盲部形態(tài)學(xué)的影響

閆云云 ，尹抗抗 ，張文將 ，梁 媛 ，趙 梁 ，盧金冬 ，譚達(dá)全 ，鄧冰湘 *

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)碩士研究生班，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2011級(jí)碩士研究生班，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

大承氣湯對不完全性腸梗阻大鼠血清中乙酰膽堿和一氧化氮及回盲部形態(tài)學(xué)的影響

閆云云1，尹抗抗2，張文將3，梁 媛3，趙 梁3，盧金冬1，譚達(dá)全4，鄧冰湘4*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)碩士研究生班，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2011級(jí)碩士研究生班，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

目的 研究大承氣湯對不完全性腸梗阻大鼠血清中乙酰膽堿（Ach）和一氧化氮(NO)含量及大鼠回盲部形態(tài)學(xué)變化的影響。方法 將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，假手術(shù)組，大承氣湯高、中、低劑量組（以下簡稱高、中、低劑量組），每組10只。除正常組外，假手術(shù)組用針線穿透腸系膜而不結(jié)扎，其余各組均造成不完全性腸梗阻模型。各組大鼠在手術(shù)造模前0.5 h及造模后連續(xù)給藥3 d。正常組、假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水，高、中、低劑量組分別給予相應(yīng)劑量的大承氣湯灌胃。運(yùn)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測大鼠血清中Ach、NO含量；對大鼠回盲部進(jìn)行切片、HE染色并觀察其形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果（1）高、中、低劑量組與模型組大鼠回盲部黏膜損傷評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高劑量組與中、低劑量組大鼠損傷評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。（2）高、中、低劑量組與模型組血清中Ach、NO含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高劑量組與中、低劑量組Ach、NO含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。結(jié)論 大承氣湯不同劑量對不完全性腸梗阻大鼠腸道可不同程度地減輕黏膜損傷，降低有害物質(zhì)的產(chǎn)生。

不完全性腸梗阻；大承氣湯；乙酰膽堿；一氧化氮；SD大鼠；回盲部

腸梗阻是臨床最常見的急腹癥之一，不僅可以引起消化道局部損傷，而且可引起全身性生理紊亂，導(dǎo)致大量相關(guān)介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，甚至引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，重者發(fā)生多器官功能障礙(multiple organs dysfunction syndrome，MODS)[1]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至危及生命[2]。中醫(yī)理論認(rèn)為六腑的主要功能為“傳化”，在生理上“六腑以通為用”，以“通降下行為順，滯塞上逆為病”。“氣機(jī)不暢，通降失和為慵”為最常見的病機(jī)，故有“不通則痛”的論斷。中醫(yī)認(rèn)為“不通則痛”是腸梗阻的發(fā)病機(jī)制，應(yīng)采用通里攻下法進(jìn)行治療。大承氣湯是通里攻下法的代表方，臨床常用來治療不完全性腸梗阻。本文采用實(shí)驗(yàn)手術(shù)方法造成大鼠不完全性腸梗阻模型，探討不同劑量的大承氣湯對不完全性腸梗阻大鼠血清中乙酰膽堿（Ach）、一氧化氮（NO）含量以及回盲部形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。現(xiàn)將方法和結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量200～260 g，均購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003，動(dòng)物編號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。質(zhì)量檢測單位：中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 藥物 大承氣湯：酒大黃12 g，厚樸24 g，枳實(shí)12 g，芒硝9 g。購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，先煎枳實(shí)、厚樸約25 min，再納入大黃煎煮10 min，去渣，然后加入溶化芒硝[3]。

1.1.3 主要儀器 DNM-9602酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；電子分析天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）；TDZ4-WS（低速自動(dòng)平衡離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；切片機(jī)（美國AO820型）、顯微鏡（麥克奧迪公司生產(chǎn)MOTIC）。

1.1.4 主要試劑 酶聯(lián)免疫法（ELISA）試劑盒：由Bio-Swamp Life Science試劑公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)時(shí)將60只實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：正常組，模型組，假手術(shù)組，大承氣湯高、中、低劑量組（以下簡稱高、中、低劑量組），每組10只。

1.2.2 造模 將大鼠用10%水合氯醛 (300 mg/kg)麻醉，備皮后碘伏消毒，酒精脫碘后于腹中線下1/3處開腹，暴露回盲部，用直徑為3.2 mm的中心靜脈管與回腸腸管并排放置，在距回盲部1 cm處用圓針和絲線穿透腸系膜繞過腸管和中心靜脈導(dǎo)管一并結(jié)扎，最后抽出中心靜脈導(dǎo)管，造成不完全性腸梗阻，然后將腹壁逐層縫合[4]。造模過程手法要輕柔以減輕對腸管的刺激，手術(shù)過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則，術(shù)后繼續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)。假手術(shù)組方法相同，只用針線穿透腸系膜而不結(jié)扎，正常組不做任何處理。預(yù)備試驗(yàn)中模型組、高劑量組、中劑量組各有1只大鼠死亡。

1.2.3 灌胃方法 各組均在手術(shù)造模前0.5 h及造模后連續(xù)給藥3 d，每天早晨9點(diǎn)開始進(jìn)行灌胃。正常組、假手術(shù)組、模型組給予相同劑量10 mL/(kg·d)的生理鹽水[1]，高、中、低劑量組給予 10 mL/(kg·d)對應(yīng)濃度的大承氣湯，灌胃含生藥分別為11.6、5.8、2.9 g/(kg·d)。其劑量根據(jù)人與大鼠的體表面積進(jìn)行換算，3種劑量呈等比數(shù)列4∶2∶1。術(shù)后要注意大鼠的保暖和傷口護(hù)理，傷口在每次灌胃后用碘伏進(jìn)行消毒，并保持籠內(nèi)墊料的干爽舒適，避免引起傷口感染。

1.3 評價(jià)方法

1.3.1 標(biāo)本的采集和保存 造模后72 h由腹主動(dòng)脈取血置入真空采血管中，然后以3 000 r/min進(jìn)行離心，離心10 min，取血清置于-20℃冰箱保存。

1.3.2 指標(biāo)檢測 采用ELISA方法檢測血清中Ach、NO含量，酶標(biāo)儀讀出的標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本的OD值，利用標(biāo)準(zhǔn)品的OD值及其相對應(yīng)的濃度，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用公式表示出來，將酶標(biāo)儀測出的值帶入并計(jì)算樣本濃度。

1.3.3 回盲部組織形態(tài)學(xué)評價(jià) 處死動(dòng)物后即刻剪取回盲部組織，用生理鹽水輕柔沖洗腸腔內(nèi)容物后，無菌濾紙吸干水分，肉眼觀察回盲部后立即浸泡于10%甲醛中，固定24 h后石蠟包埋。切片后按常規(guī)蘇木精-伊紅染色法（HE）染色。觀察其形態(tài)學(xué)改變，并參照Axaki Y[5]及Yulpinar MA[6]結(jié)腸損傷的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。見表1。

表1 病理學(xué)判斷結(jié)腸損傷的評分標(biāo)準(zhǔn) （分）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果所有數(shù)據(jù)均采用“”表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用法Dunnett，T3檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料改用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠回盲部腸黏膜形態(tài)直觀變化

模型組大鼠回盲部腸腔擴(kuò)張、充血、瘀血，蠕動(dòng)減慢甚至消失，顏色變暗，腸壁偶有炎性黏液，證明回盲部損傷較為嚴(yán)重。正常組和假手術(shù)組肉眼觀察無明顯變化，各給藥組損傷程度漸輕。大承氣湯高、中劑量組與模型組比較，回盲部黏膜形態(tài)無明顯變化。

2.2 各組大鼠回盲部腸黏膜的顯微鏡下觀察比較

HE染色后發(fā)現(xiàn)正常組和假手術(shù)組回盲部結(jié)構(gòu)無明顯變化，黏膜結(jié)構(gòu)正常。模型組回盲部黏膜有大量滲出，上皮細(xì)胞腫脹，細(xì)胞界限不清，間質(zhì)明顯水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤偶有上皮細(xì)胞壞死、脫落。大承氣湯高、中、低劑量組與模型組比較，回盲部上皮細(xì)胞腫脹減輕，炎細(xì)胞浸潤明顯減少，無明顯水腫、滲出，未發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞壞死、脫落。其中高劑量組大鼠回盲部黏膜損傷最輕，如圖1所示。

圖1 各組大鼠回盲部腸黏膜切片顯微觀察圖（HE×250）

2.3 各組大鼠回盲部黏膜損傷程度評分比較

在顯微鏡下，對腸損傷進(jìn)行觀察，依據(jù)表1的評分方法，對切片進(jìn)行評分，得出每組均值。顯示各組回盲部黏膜損傷評分的變化。正常組、假手術(shù)組回盲部組織黏膜評分均為0分；高、中、低劑量組與模型組回盲部黏膜損傷評分差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高、中、低劑量組與正常組回盲部黏膜損傷評分差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高劑量組與其中、低劑量組回盲部黏膜損傷評分差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表2。

2.4 各組大鼠Ach、NO含量比較

與正常組比較血清中Ach、NO含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；大承氣湯高、中、低劑量組與模型組比較，血清中Ach、NO含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)；大承氣湯高劑量組與其中、低劑量組比較，血清中Ach、NO含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表3。

表2 各組大鼠回盲部黏膜損傷程度評分比較 （）

表2 各組大鼠回盲部黏膜損傷程度評分比較 （）

注：與正常組比較＃＃P<0.01；與模型組比較**P<0.01；與高劑量組比較△△P<0.01。

組 別正常組模型組假手術(shù)組高劑量組中劑量組低劑量組藥物(kg·d)10 mL 10 mL 10 mL 11.6 5.8 2.9 n 10 9 10 9 9 1 0損傷評分（分）0**12.01±1.21##0**4.80±1.03**##6.87±1.13**##△△9.47±1.24**##△△

表3 各組大鼠實(shí)驗(yàn)后血清中Ach、NO水平的比較（）

表3 各組大鼠實(shí)驗(yàn)后血清中Ach、NO水平的比較（）

注：與正常組比較＃＃P<0.01；與模型組比較**P<0.01；與高劑量組比較△P<0.05。

組 別正常組模型組假手術(shù)組高劑量組中劑量組低劑量組藥物(kg·d)10 mL 10 mL 10 mL 11.6 5.8 2.9 n 10 9 10 9 9 1 0 Ach（pmol/L）44.29±6.03**87.01±7.88##△60.89±7.80**##△49.72±3.85**60.54±8.92**##△63.39±8.22**##△NO（μmol/L）2.41±0.34**4.68±0.88**##△3.26±0.68**##△2.61±0.31**2.88±0.31**△3.56±0.88**＃?！?/p>

3 討論

國內(nèi)外研究已經(jīng)證明，在創(chuàng)傷及感染等應(yīng)激情況下，腸黏膜屏障功能受到了削弱和損害，易致腸梗阻的發(fā)生，使腸道細(xì)菌、毒素侵入血液循環(huán)，在一定條件下激發(fā)細(xì)胞因子和其它炎性介質(zhì)的連鎖反應(yīng)，引起嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，嚴(yán)重時(shí)可致全身各器官的損害，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭而死亡[7]。有研究表明大承氣湯聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)治療腸梗阻臨床癥狀得到很大改善，促進(jìn)炎性滲出液的吸收，縮短治療時(shí)間，臨床有效率達(dá)到97.37%，顯著高于單純西藥常規(guī)保守治療（81.58%）[8]。

中醫(yī)治療腸梗阻多以“六腑以通為用”為原則，治則以通里攻下法為主。減輕腸腔壓力，疏通腸道，改善血運(yùn)，減輕過氧化損傷；通里攻下中藥對腸道屏障功能具有明顯的保護(hù)作用。大承氣湯是張仲景《傷寒論》中治療腑實(shí)證的最具代表性的經(jīng)典方，方由大黃、芒硝、枳實(shí)、厚樸四味藥組成，方中大黃瀉熱通便，蕩滌腸胃，為君藥。芒硝助大黃瀉熱通便，并能軟堅(jiān)潤燥，為臣藥，二藥為用，峻下熱結(jié)之力甚強(qiáng)；厚樸、枳實(shí)行氣散結(jié)，消痞除滿，并助硝、黃推蕩積滯以加速熱結(jié)之排泄，共為佐使。現(xiàn)代臨床及實(shí)驗(yàn)性研究大承氣湯在促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)、降低腸道里的Ach、NO分泌、保護(hù)組織器官功能等方面均有重要的作用。

乙酰膽堿可明顯興奮腸道平滑肌，使其收縮幅度、張力、蠕動(dòng)增加，引起惡心、噯氣、嘔吐、腹痛及排便障礙等癥狀。故減少Ach的分泌對減輕腸梗阻引起的胃腸癥狀起重要作用。腸內(nèi)容物停滯和腸道高分泌，使腸內(nèi)壓力增加，腸管擴(kuò)張，腸壁血液循環(huán)障礙，黏膜缺血缺氧，從而損壞黏膜的屏障功能[9]，導(dǎo)致腸黏膜形態(tài)學(xué)的改變。腸梗阻導(dǎo)致各種有毒物質(zhì)堆積腸道產(chǎn)生各種毒素誘導(dǎo)NO合酶生成，并持續(xù)不斷地增加，從而釋放大量NO[10]。Ach、NO對組織器官有直接毒性作用，可以滅活與能量代謝或抗氧化有關(guān)的酶，直接損傷DNA，導(dǎo)致能量衰竭和細(xì)胞死亡。其作用于腸壁，可引起腸道通透性增高，導(dǎo)致細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥[11]。

本實(shí)驗(yàn)中模型組血清Ach、NO含量顯著高于正常組和大承氣湯高、中、低劑量組(P<0.01)，提示模型組刺激Ach、NO的釋放大幅度增加入血，大承氣湯對體內(nèi)Ach、NO的釋放起到抑制作用，從而減輕因這兩種物質(zhì)釋放引起的器官毒性反應(yīng)、腸管擴(kuò)張、惡心、嘔吐、腹痛以及排便障礙等癥狀；減少因血清中Ach、NO含量增加引起各種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、釋放和腸源性炎性介質(zhì)的吸收。大承氣湯高劑量組與中、低劑量組相比，血清中Ach、NO含量均有明顯降低(P<0.05)，其高劑量組對減少血清中Ach、NO含量的作用明顯優(yōu)于中、低劑量組。觀察回盲部黏膜的損傷程度并進(jìn)行評分，模型組大鼠回盲部損傷評分顯著高于正常組和大承氣湯高、中、低劑量組(P<0.01)，大承氣湯高劑量組回盲部損傷與其中、低劑量組相比，顯著減輕(P<0.01)，以上對比提示實(shí)驗(yàn)研究對臨床上采用大承氣湯治療不完全性腸梗阻引起的血清Ach、NO含量增加以及回盲部損傷有非常好的應(yīng)用前景，且大承氣湯高劑量對不完全性腸梗阻的治療具有較大的影響作用，臨床使用時(shí)應(yīng)充分考慮到大承氣湯的劑量，以達(dá)到其最佳療效。

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（本文編輯 徐愛良）

Effects of Dachengqi Decoction on serum acetylcholine and nitric oxide and ileocecum morphology in rats with incomplete intestinal obstruction

YAN Yunyun1,Yin Kangkang2,ZHANG Wen Jiang3,LIANG Yuan3,ZHAO Liang3,LU Jindong4,DENG Bingxiang4
(1.2012 master degree candidate,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China；2.Experimental Animal Center,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China;3.2011 master degree candidate,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China；4.Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To study the effects of Dachengqi Decoction on serum acetylcholine(Ach)and nitric oxide(NO)and ileocecum morphology in rats with incomplete intestinal obstruction.Methods 60 SD rats were randomly divided into normal group,model group,sham operation group,Dachengqi Decoction high,medium and low dose group with 10 rats in each group.Except normal group without any treatment and the sham operation group treated with needle penetration mesenteric without ligation,the other groups were prepared for incomplete intestinal obstruction model.These rats were administered 0.5 h before modeling and continuously for 3 days after modeled. The normal group, sham operation group, model group were treated with normal saline, the high, medium,low dose group were treated with the same volume of Dachengqi Decoction.(1)content of acetylcholine(Ach),nitric oxide(NO) in serum were detected using enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).(2)morphological changes of ileocecum were observed by H-E staining. Results(1) There were the significant differences between model group and high,medium,low dose group in scores of ileocecum mucosa injury(P＜0.01).There were also significant differences between high dose group and medium,low dose group in scores of ileocecum mucosa injury(P＜0.01);(2)There were significant differences between model group and high,medium,low dose group in the contents of serum Ach and NO(P＜0.01).There were also significant differences between high dose group and medium,low dose group in the contents of serum Ach and NO(P＜0.01,P＜0.05).Conclusion The Dachengqi Decoction can reduce intestinal mucosa injury and the production of harmful materials in rats with incomplete intestinal obstruction in a dose-dependent manner.

incomplete intestinal obstruction;Dachengqi Decoction;acetylcholine;nitric oxide;SD rats;ileocecum

R285.5；R574.2

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.03.004.012.05

2013－11－08

湖南省自然基金資助項(xiàng)目（09JJ6040）。

閆云云，女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)理論治則與治法研究。

* 鄧冰湘，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：dbxhncs@sohu.com。