HPLC測定山銀花藥材中常春藤皂苷元的含量

劉玉琴，謝 誼，彭艷梅，王實強，楊 瑛*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙 410013）

HPLC測定山銀花藥材中常春藤皂苷元的含量

劉玉琴1，2，謝 誼2，彭艷梅2，王實強2，楊 瑛1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙 410013）

目的 建立山銀花藥材中的常春藤皂苷元含量的測定方法。方法 以鹽酸-乙醇溶液為水解溶劑，山銀花樣品加熱回流4 h，再用三氯甲烷萃取；采用HPLC，以Waters Symmetry C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，甲醇-0.4%冰醋酸水溶液（80∶20）為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為210 nm，測定常春藤皂苷元含量。結(jié)果 山銀花中常春藤皂苷元的線性范圍為2～12 μg，平均加樣回收率99.0%，RSD為1.9%。不同產(chǎn)地山銀花的常春藤皂苷元含量差異較大，湖南隆回野生的含量高達2.8%，而云南、貴州產(chǎn)的未檢出。結(jié)論 所建立方法操作簡便、準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可用于山銀花藥材中常春藤皂苷元的含量測定。

山銀花；常春藤皂苷元；酸水解；含量測定；高效液相色譜法

山銀花是我國常用的一味傳統(tǒng)中藥材，從2005年版《中華人民共和國藥典》開始，將金銀花與山銀花分列為兩項，規(guī)定金銀花的植物來源只有忍冬1種；山銀花植物來源有3種，而2010年版《中華人民共和國藥典》又新增了1個品種，故山銀花植物來源一共有4種， 分別為忍冬科植物灰氈毛忍冬 Lonicera macranthoides Hand-Mazz.、 紅腺忍冬 Lonicera hypoLauca Miq.、華南忍冬 Lonicera confuse DC.或黃褐毛忍冬Lonicera fuLvotomentosa Hsu et S.C.Cheng，其為上述4種植物的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，常用于熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等[1]。

山銀花所含化學(xué)成分多樣，主要含黃酮類、有機酸類、苷類和揮發(fā)油類等[2-3]。其中苷類成分主要為常春藤皂苷類，此類成分是山銀花中除綠原酸類成分之外所含的主要藥效成分，故2010年版《中華人民共和國藥典》在2005年版的基礎(chǔ)上中增加了灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙作為山銀花藥材的質(zhì)量評價指標(biāo)，這兩種皂苷均屬于常春藤皂苷，由于這兩種皂苷只有未端紫外吸收，藥典采用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）測定這兩種皂苷的含量。本研究擬用HPLC測定山銀花藥材中皂苷經(jīng)酸水解后得到的常春藤皂苷元的含量，以間接控制山銀花藥材中總?cè)圃碥盏暮俊，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

LC-10AT高效液相色譜儀和SPD-10AVP紫外可見檢測器(日本島津公司)；N2000雙通道色譜工作站 (浙江大學(xué)智能信息工程研究所)；AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 對照品與藥材

常春藤皂苷元對照品 （中國食品藥品檢定研究所，供含量測定用，批號：111733-201205）；山銀花藥材：2批采于湖南隆回，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所生藥室鑒定，為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.的干燥花蕾或帶初開的花；另7批購于湖南長沙、廣西、四川、云南及貴州等地藥房，種屬不詳；樣品來源見表2。

1.3 試劑

甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersSymmetryC18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.4%冰醋酸水溶液（80∶20）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。對照品與供試品色譜圖見圖1。

圖1 常春藤皂苷元對照品（A）和山銀花藥材（B）的HPLC圖

2.2 供試品溶液的制備

取山銀花藥材粉末 （過四號篩）0.2 g，精密稱定，置 100 mL錐形瓶中，精密加入 50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL于100 mL圓底燒瓶中，加入濃鹽酸3 mL，加熱回流4 h，靜置，冷卻后，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，三氯甲烷提取6次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取常春藤皂苷元對照品10.0 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得常春藤皂苷元對照品儲備液（1.00 mg/mL）。精密量取該儲備液適量，用甲醇稀釋成濃度為500 μg/mL的溶液，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察

精密量取對照品儲備液2、4、6、8、10、12 μL，按照“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，記錄各色譜峰面積，以峰面積（Y）對進樣量（X，μg）進行線性回歸，得回歸方程為：

常春藤皂苷元在2~12 μg線性范圍內(nèi)與峰面積成良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密量取對照品溶液（500 μg/mL）10 μL，按照“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定，記錄各次峰面積。結(jié)果得峰面積的RSD為0.9%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一份（湖南隆回種植）山銀花藥材粉末（過四號篩）按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h精密量取10 μL進樣測定，記錄各次峰面積，計算得常春藤皂苷元峰面積的RSD為1.1%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一份（湖南隆回種植）山銀花藥材粉末（過四號篩）6份，每份0.2 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，精密量取各溶液10 μL，注入液相色譜儀，按外標(biāo)法計算常春藤皂苷元的含量。6份樣品中常春藤皂苷元的平均含量為21.3 mg/g，其RSD為1.9%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗

取已知含量 （湖南隆回種植）的山銀花粉末6份，每份約0.1 g，精密稱定，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液 （酸水解時精密加入對照品適量），精密量取10 μL，注入色譜儀，記錄常春藤皂苷元峰面積，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.9 樣品測定

取所收集的9批不同產(chǎn)地的山銀花藥材，每批各2份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液和“2.1”項下方法測定，以干燥品計算，得樣品中常春藤皂苷元的平均含量，結(jié)果見表2。

表2 9批山銀花中常春藤皂苷元含量 （n=2）

3 討論

樣品處理方法的選擇：硫酸酸水解[4]：采用2 mol/mL的硫酸溶液對山銀花樣品中的皂苷進行水解，再用三氯甲烷為溶劑索氏提取常春藤皂苷元。測得的常春藤皂苷元含量較高，提示該法對常春藤皂苷元的提取較為完全，但是此法較費時，整個過程歷時10 h左右；鹽酸-乙醇水解，石油醚（60～90℃）萃?。捍朔y得的常春藤皂苷元含量較硫酸水解的低得多。鹽酸-乙醇水解，三氯甲烷萃?。捍朔y得的常春藤皂苷元含量與硫酸水解的接近；鹽酸-乙醇水解-二氯甲烷萃?。捍朔y得的常春藤皂苷元含量最低。從操作是否簡便、時間長短及對皂苷元提取完全與否等方面綜合考慮，本實驗采用鹽酸-乙醇水解皂苷，再采用三氯甲烷萃取皂苷元，采用此法常春藤皂苷水解較為徹底，對皂苷元的提取也比較完全，且操作相對較簡便，耗時較少。

流動相的篩選：本實驗對甲醇-水、甲醇-冰醋酸水溶液這兩種流動相系統(tǒng)進行了比較篩選，甲醇-水系統(tǒng)無論怎樣調(diào)節(jié)兩者比例均未得良好峰形的峰，而換用甲醇-0.4%冰醋酸水溶液系統(tǒng)作為流動相時得到的常春藤皂苷元峰形好，柱效高，推測與常春藤皂苷元結(jié)構(gòu)中含有羥基和羧基有關(guān)，故經(jīng)試驗最終選定甲醇-0.4%的冰醋酸水溶液作為本實驗的流動相。

測定波長的選擇：常春藤皂苷元在205 nm波長處有最大吸收，但由于甲醇的截止波長為205 nm，選用此波長來檢測時溶劑有吸收，對測定造成干擾，故選用210 nm作為測定波長，以保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本次試驗收集的山銀花藥材分別來自湖南、廣西、四川、貴州、云南5個省9批樣品，常春藤皂苷元含量測定結(jié)果顯示，來源于不同省的山銀花的含量具有較大的差異，湘產(chǎn)的山銀花含量較高，而在云南、貴州產(chǎn)的未檢測出常春藤皂苷元。

2010年版《中華人民共和國藥典》采用蒸發(fā)光散射檢測器來測定山銀花中2種皂苷的含量，實驗操作不方便，需配置高壓氮氣或空氣，設(shè)備較昂貴，使用成本高，且實驗過程中產(chǎn)生的廢氣有害，加之其檢測的靈敏度較紫外檢測器的低。而本文建立了RP-HPLC測定山銀花中常春藤皂苷元含量，操作簡便，測定結(jié)果準(zhǔn)確，方法重復(fù)性好，可作為山銀花質(zhì)量控制的有效方法。

[1]國家藥典編輯委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：28-29.

[2]粟時穎，鄭 興，廖端芳.山銀花研究進展[J].南華大學(xué)學(xué)報，2009，37(6)：744.

[3]王志萍，鄧家剛，王 勤，等.山銀花研究的最新進展[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，11(4)：59-60.

[4]馬雙成，劉 燕，畢培曦，等.RP-HPLC法測定金銀花藥材中常春藤皂苷元及齊墩果酸的含量[J].藥物分析雜志，2006，26(7)：885-887.

（本文編輯 徐愛良）

HPLC Determination of Hederagenin in Flos Lonicerae Confusae

LIU Yuqing1,2,XIE Yi2,PENG Yanmei2,WANG Shiqiang2,YANG Ying1*
(1.Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China; 2.Research Institute of Chinese Medicine,Hunan Academy of CM,Changsha,Hunan 410013,China)

ObjectiveTo establish a new method for the determination of hederagenin in Flos Lonicerae Confusae.MethodsThe herb was hydrolyzed with hydrochloric acid-ethanol for 4 hours at 80℃ and the hederagenin was extracted with chloroform and analyzed by HPLC.The Waters Symmetry-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）was used with the mobile phase of methanol-0. 4%glacial acetic acid(80:20),the flow rate was 1.0 mL/min,the column temperature was 30℃, the detected wavelength was 210 nm.Results The linear range of hederagenin was 2～12μg,the recovery rate was 99.0%,RSD was 1.9%.The content of hederagenin in Flos Lonicerae Confusae was varied with growing areas.The content of hederagenin of wild species from Longhui of Hunan province is up to 2.8%,while the hederagenin of the species from Yunnan and Guizhou province has not been detected.ConclusionThe developed method is convenient,precision and repeatability,which can be used to determine the content of hederagenin in Flos Lonicerae Confusae.

Flos Lonicerae Confusae;hederagenin;acid hydrolysis;content determination;HPLC

*楊 瑛，女，研究員，E-mail：fanfeihe@126.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.03.008.028.03

2013－10－27

長沙市科技局科技攻關(guān)資金專項資助(K1203019-31)；湖南省屬科研機構(gòu)技術(shù)創(chuàng)新發(fā)展專項資助（2012TF1005）。

劉玉琴，女，在讀碩士研究生，研究方向：藥物化學(xué)。

·名醫(yī)擷華·