復(fù)方丹參片對阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型Tau蛋白表達(dá)的影響

劉利娟 ，周德生 *，肖志杰 ，陳 瑤 ，胡 華，孫曉鵬 ，覃仁安

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長沙 410007；2.湖南湘雅醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長沙 410011；3.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司現(xiàn)代中藥研究院，廣東 廣州 510515）

復(fù)方丹參片對阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型Tau蛋白表達(dá)的影響

劉利娟1，周德生1*，肖志杰2，陳 瑤1，胡 華1，孫曉鵬1，覃仁安3

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長沙 410007；2.湖南湘雅醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長沙 410011；3.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司現(xiàn)代中藥研究院，廣東 廣州 510515）

目的 研究復(fù)方丹參片對阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型微管相關(guān)蛋白（Tau蛋白）表達(dá)的影響。方法 將SD大鼠隨機分成復(fù)方丹參片0.5、1、2、4倍劑量組、空白對照組及多奈哌齊組，分別灌服相應(yīng)藥液，空白組給予等容積生理鹽水，1次/日，連續(xù)7 d之后，取各組血清培養(yǎng)AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，于24、48、72 h采用Western Blot法分析AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞Tau蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與空白對照組相比，24 h時復(fù)方丹參片1、2、4倍劑量組能降低Tau蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；48 h時復(fù)方丹參片2、4倍劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；72 h時各劑量組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 復(fù)方丹參片2倍劑量48 h時能顯著減少AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型Tau蛋白表達(dá)。

復(fù)方丹參片；Tau蛋白；阿爾茨海默??；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一組原因未明的原發(fā)性腦變性疾病，以認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，在世界各地發(fā)病率仍呈上升趨勢[1]。AD以蛋白聚合物組成的神經(jīng)纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangles，NFTs）為主要特點之一，NFTs的主要成分為過度磷酸化的Tau蛋白[2]。正常情況下，Tau蛋白在神經(jīng)元中可促進(jìn)微管形成，穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)并影響微管動力學(xué)[3]；但在蛋白激酶和蛋白磷酸酶動態(tài)調(diào)節(jié)失衡的情況下，Tau蛋白被過度磷酸化，使其與微管蛋白的結(jié)合只有正常Tau蛋白的10%，從而使正常神經(jīng)元功能損傷[4]；同時過度磷酸化的Tau蛋白聚集，誘導(dǎo)AD發(fā)生。所以本實驗采用復(fù)方丹參片含藥血清對AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù)，觀察Tau蛋白表達(dá)情況，為中醫(yī)藥防治AD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物 復(fù)方丹參片，規(guī)格：0.32 g/片（相當(dāng)于飲片0.6 g），廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供，批號：COA002；鹽酸多奈哌齊片，規(guī)格：5 mg/片，陜西方舟制藥有限公司，批號：100801053。用時以蒸餾水溶散。

1.1.2 動物 SPF級SD大鼠60只，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(湘)2009-0004；體質(zhì)量 200～250 g，雌雄不拘。

1.1.3 主要試劑及儀器 Tau(1∶200，Proteintech公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（1∶5000，碧云天公司），Western blot檢測發(fā)光試劑盒（Millipore公司）聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，Pall Gelman Laboratory 公司)，蛋白 Marker(Fermentas公司)，ImageQuant350化學(xué)發(fā)光成像儀（美國GE公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 將前期實驗參照馮莉[5]方法構(gòu)建成功的AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型（美國Pittsburgh大學(xué)Perez博士惠贈，湘雅醫(yī)學(xué)院馮莉博士轉(zhuǎn)贈的pcDNA3.1／APP595／596并列突變質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人胚腎HEK293細(xì)胞[6]）冷凍管迅速由液氮轉(zhuǎn)入到37℃水浴箱中，完全解凍后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到事先配好的10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 含藥血清制備 SPF級SD大鼠60只，按體質(zhì)量分層隨機分為復(fù)方丹參片0.5、1、2、4倍劑量組、空白對照組及多奈哌齊組，10只/組，分別用于制備空白對照血清和含藥血清。劑量根據(jù)成人每日臨床用量按人與動物之間藥物劑量換算而成，即大鼠每日復(fù)方丹參片藥量為 315.0 mg／kg，0.5、1、2、4 倍劑量組分別以157.5、315.0、630.0、1260.0 mg／kg 灌服復(fù)方丹參片藥液；多奈哌齊作為陽性對照藥，藥量為5.8 mg／kg灌服藥液；空白對照組灌以等容積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，無菌條件下，腹主動脈取血，分離血清，56℃，30 min滅活補體，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 含藥血清培養(yǎng)AD細(xì)胞模型 取對數(shù)生長期AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型，以1×105/mL密度每孔2 mL接種于六孔板。待細(xì)胞的融合率為85%～90%時，分別依次添加空白血清及含0.5、1、2、4倍復(fù)方丹參片血清及多奈哌齊血清。添加前先以無血清的DMEM洗細(xì)胞2次。每次5個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.4 用Western Blot方法檢測Tau蛋白表達(dá) 各劑量組分別于培養(yǎng)24、48、72 h后，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行Tau蛋白表達(dá)的檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件進(jìn)行處理，計量資料數(shù)據(jù)用表示，所有資料進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗，檢驗符合正態(tài)分布、方差齊時采用單因素方差分析（One-way ANOVA），用LSD法；方差不齊時用Dunnett’s T3法；不符合正態(tài)分布，多組比較時采用Kruskal-Wallis檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

與空白對照組相比，1倍劑量組在24 h時Tau蛋白表達(dá)降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；2、4倍劑量組及多奈哌齊組在24、48 h時Tau蛋白表達(dá)均降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

復(fù)方丹參片各劑量組組間比較：與0.5倍劑量組相比，1倍劑量組在24 h時Tau蛋白表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；2、4倍劑量組24、48 h差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與1倍劑量組相比，2、4倍劑量組，48 h Tau蛋白的表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。2、4倍劑量組之間比較：48 h差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

各組不同時間點比較：1倍劑量組組內(nèi)，24 h時Tau蛋白表達(dá)與48、72 h相比差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；2倍劑量組、多奈哌齊組組內(nèi)，24、48 h 與 72 h相比，Tau蛋白表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），24、48 h間差異則無統(tǒng)計學(xué)意義；4倍劑量組內(nèi)，24與48 h比較Tau蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與72 h相比差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），48 h與72 h相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1及圖1。

表1 各組AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞藥物作用后Tau灰度值的變化 （，n=6）

表1 各組AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞藥物作用后Tau灰度值的變化 （，n=6）

注：組內(nèi)各時間點比較：與48 h比較#P<0.05，##P<0.01，與72 h比較*P<0.05，**P<0.01；不同組比較：與空白對照組比較△P＜0.05，△△P<0.01，與多奈哌齊組比較▲▲P<0.01；復(fù)方丹參片各組間比較：與1倍組比較☆P＜0.05，☆☆P<0.01，與2倍組比較★★P<0.01，與4倍組比較◇P＜0.05，◇◇P<0.01.

空白對照組×0.5復(fù)方丹參片組×1復(fù)方丹參片組×2復(fù)方丹參片組×4復(fù)方丹參片組多奈哌齊對照組24 h 0.885±0.041 0.881±0.063▲▲☆☆★★◇◇0.610±0.051##**△△0.632±0.053**△△0.628±0.063#**△△0.624±0.042**△△48 h 0.878±0.051 0.876±0.048▲▲★★◇◇0.810±0.046▲▲★★◇0.594±0.040**△△◇◇0.737±0.046*△△▲▲0.608±0.049**△△72 h 0.888±0.052 0.871±0.051 0.873±0.052 0.871±0.057 0.841±0.061 0.809±0.063組 別

圖1 各組不同時間點Tau蛋白表達(dá)量Western Blot條帶電泳圖

3 討論

Tau蛋白大量存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)并在神經(jīng)元的軸突有顯著地表達(dá)，在AD患者的腦脊液中也可發(fā)現(xiàn)，其功能主要是與微管蛋白結(jié)合形成微管，保持神經(jīng)細(xì)胞的極性和微管系統(tǒng)的穩(wěn)定性。理論上Tau蛋白能夠磷酸化的位點有30個左右，但實際研究表明，正常成人每分子Tau蛋白能夠磷酸化的位點只有2-3個，其磷酸化的程度與微管蛋白結(jié)合能力成反比。Wang H等研究表明，異常過度磷酸化的Tau蛋白聚集與AD患者臨床癡呆程度呈正相關(guān)[7]。同時證實過度磷酸化的Tau蛋白不能與微管蛋白結(jié)合，且對蛋白水解酶的抗性增加，產(chǎn)生神經(jīng)毒性[8]。在體外試驗中亦證實，Tau蛋白過度磷酸化可使其與微管結(jié)合的能力下降，從而減弱對微管的穩(wěn)定作用[9]。不穩(wěn)定的微管系統(tǒng)極易解體，使軸漿的轉(zhuǎn)運能力下降甚至喪失，最終軸突退化丟失，神經(jīng)元喪失其功能，從而引起癡呆癥狀。淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）是AD發(fā)病的關(guān)鍵蛋白，APP可以被 α-，β-，γ-蛋白酶分解；其中 β-和 γ-蛋白酶的連續(xù)作用可使APP被分解產(chǎn)生Aβ。Aβ可以導(dǎo)致腦內(nèi)老年斑的形成和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，亦是導(dǎo)致阿爾茨海默病的重要因素。目前研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可使神經(jīng)細(xì)胞蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶 (protein phosphatase，PP)系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致Tau蛋白異常磷酸化[10-11]。

復(fù)方丹參片在臨床中不僅用于冠心病的治療，現(xiàn)在亦逐漸用于AD疾病治療，依據(jù)如下：1）心腦同治理論：一方面張錫純提出“心腦息息相通，其神明自湛然長醒”，明確指出了心腦共主神明說。2）活血化瘀法在癡呆中的應(yīng)用：癡呆病位在腦，瘀血停滯為重要病機，如《血證論》言 “血在上，則濁蔽而不明矣”。同時研究發(fā)現(xiàn)癡呆的發(fā)生與腦循環(huán)障礙密切相關(guān)，且其嚴(yán)重程度與腦血流障礙、全腦血流量的降低成正比[12]，所以活血化瘀是癡呆的重要治法之一。3）復(fù)方丹參片治療AD的實驗研究：覃仁安[13]等研究證實了復(fù)方丹參片可以提高AD大鼠模型學(xué)習(xí)記功能；還可通過減少β淀粉樣前體蛋白在AD模型大鼠腦內(nèi)的表達(dá)來改善AD的癥狀[14]。同時復(fù)方丹參片還可以降低AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型中淀粉樣前體蛋白mRNA的表達(dá)[15]。近期通過實驗[16]發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參片可以減少AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型Aβ的生成。單味中藥丹參的有效成分丹參酮對Tau蛋白的磷酸化亦有一定的抑制作用，能夠減少NFTs的形成，減輕神經(jīng)毒性[17]；同時丹參酮可降低Aβ的表達(dá)[18]。

本次實驗研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)方丹參片培養(yǎng)AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型24 h時，與空白對照組比較1倍、2倍、4倍劑量組能夠降低Tau蛋白水平（P<0.01）。48 h時，2倍、4倍劑量組差異則有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。分析認(rèn)為這種變化與藥物有效濃度以及細(xì)胞對藥物的代謝能力有關(guān)，當(dāng)藥物達(dá)到有效濃度時，通過降低Tau的表達(dá)而抑制Tau過度磷酸化，減少NFTs的形成，從而減輕AD的癥狀；當(dāng)細(xì)胞對藥物進(jìn)行代謝后，藥物濃度降低，達(dá)不到有效濃度，進(jìn)而對Tau蛋白的表達(dá)不產(chǎn)生影響。盡管本實驗對AD轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型Tau蛋白表達(dá)量進(jìn)行了檢測，也證實了復(fù)方丹參片在一定程度上可以抑制Tau蛋白的過度磷酸化，但復(fù)方丹參片是通過上調(diào)PP2A的表達(dá)而抑制Tau蛋白過度磷酸化，還是通過影響Aβ-Tau蛋白相關(guān)通路來減輕Tau過度磷酸化，以及對基因水平有無影響有待進(jìn)一步探討。

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（本文編輯 楊 瑛）

The effect of Compound Danshen Tablets on the Expression of Tau in AD Transgenic Cell Model

LIU Lijuan1,ZHOU Desheng1*,XIAO Zhijie2,CHEN Yao1,HU Hua1,SUN Xiaopeng1,QIN Renan3
(1 Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;2 Department of Neurology,the Second Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410011,China;3 Modern Chinese Medicine Research Institute of Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong 510515,China)

Objective Study on the expression of the Tau that AD transgenic cell has been cultured by Danshen Tablets(DT).Methods SD rats were randomly divided into 6 groups,including 0.5 dose, 1.0 dose, 2.0 dose, 4.0 dose DT groups, blank control group and donepezil group.Each group rats respectively were given different concentrations of drugs,blank group was given equalnormalsaline,1 time a day,7 days in a row.Theneach containing medicine serum of rats were taken to cultivate the AD transgenic cells,and using the methods that Western blot to test the levels of Tau protein after cultured 24 h,48 h,72 h.Results Compared with the blank control group,At 24 h time point,the expression of Tau were declined by 1×,dose of DT,there were significant effects(P＜0.01);At 48 h,2×and 4× dose of DT,it still had significant effects(P＜0.01);At 72 h,there are non-significant effect with all the dose groups of DT(P＞0.05).Conclusion 2× dose of DCT could reduce the level of Tau obviously at 48 h on the AD transgenic cell model.

compound danshen tablets;tau protein;Alzheimer disease;transgenic cell model

R741；R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.05.004.014.05

2013-11-27

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項資助項目（2011X09201-201-01）；湖南省自然科學(xué)基金資助項目（14JJ6038）；湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計劃資助項目（2014SK3037）。

劉利娟,女，博士研究生,研究方向:中醫(yī)藥防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。

*周德生，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，Email:2478020529@qq.com。