父親年齡對精子基因組及子代健康的影響

劉小章 岳煥勛

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川省人口和計劃生育科研所（610041）；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院

由于多種社會經(jīng)濟(jì)因素，推遲生育已成為現(xiàn)代社會的普遍趨勢，由此引發(fā)了許多對隱藏在生育高齡化過程中的風(fēng)險和后果的擔(dān)憂［1-4］。女方高齡是不孕、流產(chǎn)、子代遺傳缺陷最重要的危險因素已獲得公認(rèn)。雖然男方是否也存在類似的年齡依賴效應(yīng)尚不明了，但文獻(xiàn)中已有大量有關(guān)年齡對生殖激素生成、性功能、睪丸組織結(jié)構(gòu)、精液質(zhì)量、生育力的影響［4-6］，以及父親高齡與不良生育結(jié)局和遺傳缺陷相關(guān)的證據(jù)［7-10］。對高齡父親的年齡尚無明確界定，通常以受孕時男方≥40歲為標(biāo)準(zhǔn)［11］。

由于年齡、生活方式及環(huán)境因素密切相關(guān)，在生育研究中區(qū)分父、母年齡影響的難度較大。直接評價雄性生殖細(xì)胞則可繞開這一難題，從而識別單純父系危險因素［5，12］。

1 高齡男子染色體改變

染色體畸變是最先觀察到的基因組完整性隨年齡而下降的表現(xiàn)之一。人外周血淋巴細(xì)胞染色體分析證實(shí)各種基因組改變（非整倍體、易位、無著絲粒斷片、染色體缺失、微核形成）的發(fā)生率隨年齡呈線性增加［13］，引發(fā)了對男性生殖細(xì)胞某些染色體改變是否也會隨年齡增加的擔(dān)憂。

1.1 非整倍體

人類最常見的遺傳性染色體異常，大多源于減數(shù)分裂過程中同源染色體不分離或染色體丟失［14-15］，是導(dǎo)致流產(chǎn)和不育的主要原因之一。45，X單倍體和16、21、22三倍體占非整倍體流產(chǎn)胚胎的60%。所有常染色體單倍體都是致死性的，僅13、18、21及性染色體三倍體胎兒可存活至出生（占初生兒的0.3%）［16］。已知母親高齡是三體形成的高危因素，其風(fēng)險呈線性（16三體）或呈指數(shù)性（21三體）增高［13］。父親年齡是否與非整倍體發(fā)生相關(guān)仍有爭議。人精子-倉鼠卵穿透實(shí)驗(yàn)揭示正常男子有2%～3%的精子攜帶非整倍體核型。有研究報告在控制母親年齡后，父親＞50歲，其子女發(fā)生21三體的風(fēng)險為25～29歲父親的2倍［17］；當(dāng)母親年齡≥40歲時，父親年齡對子代罹患唐氏綜合征的影響達(dá)到50%［18］，但父親年齡對21三體及其他常染色體三體發(fā)生的影響并未被多數(shù)研究證實(shí)［5，13］。相對于常染色體，性染色體非整倍體則顯示明顯的父本傳遞特征。性染色體非整倍體總發(fā)生率約為0.2%。估計出生時約55%的性染色體非整倍體為父性起源，其比例在47，XXX、47，XXY、45，X、47，XYY分別為6%、50%、80%、100%［13-19］。應(yīng)用熒光原位 雜交技術(shù)（FISH）研究性染色體，結(jié)果提供了雄性生殖細(xì)胞內(nèi)年齡相關(guān)非整倍體增加的證據(jù)。在11篇精子FISH研究中，有9篇顯示年齡對性染色體非整倍體發(fā)生有正向影響。＞50歲男子攜帶24，XY核型精子（第一次減數(shù)分裂錯誤）的風(fēng)險和生成X或Y二倍體精子（第二次減數(shù)分裂錯誤）的頻率分別增高2～3倍［12］。對二倍體精子發(fā)生率與父親年齡的關(guān)聯(lián)亦有爭議，有報道年長男子二倍體精子發(fā)生率比年輕者約高2倍，而其他包括許多樣本量較大的研究未發(fā)現(xiàn)類似影響［12-13］。

1.2 染色體結(jié)構(gòu)異常

新生兒、死產(chǎn)胎兒及自然流產(chǎn)胚胎（或胎兒）的染色體結(jié)構(gòu)異常發(fā)生率分別為0.25%、0.4%和2%。估計約80%的新生畸變源于雄性生殖細(xì)胞。正常健康男子精子染色體結(jié)構(gòu)異常發(fā)生率為0～13%，平均6%～7%［19］。陣列對比基因組雜交分析確定攜帶平衡易位和異常表型男子全部新生微缺失均來源于父親，其他研究報告100%的復(fù)發(fā)新生易位，即t（11；22）和96%的非復(fù)發(fā)平衡相互易位為父系遺傳［20-21］。盡管表現(xiàn)出父系起源的強(qiáng)勢，但相對于更容易檢測的非整倍體綜合征，活產(chǎn)兒染色體結(jié)構(gòu)異?？傮w發(fā)生率低下，通過人類子代流行病學(xué)研究確定父親年齡的影響一直極為困難。

嚙齒動物研究首次發(fā)現(xiàn)精子染色體結(jié)構(gòu)畸變隨年齡增加的證據(jù)，但減數(shù)分裂前、后生精細(xì)胞所受影響不同，年長動物晚期精子細(xì)胞不穩(wěn)定畸變率顯著增高。通過精子傳遞的不穩(wěn)定染色體畸變可能具有胚胎致死性，也可能在合子內(nèi)被重排。年齡相關(guān)的精子不穩(wěn)定損傷增加可能增加子代染色體重排的風(fēng)險［13］。采用人精子-倉鼠卵穿透實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，≥45歲已生育男子的精子染色體結(jié)構(gòu)異常為20～24歲男子的4倍（13.6%，2.8.0%）。Sloter等［13］對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行了重新分析，證實(shí)該影響幾乎全是由于染色體斷裂的顯著增加，無著絲粒斷片增加不明顯，提示減數(shù)分裂后缺乏DNA修復(fù)的精子細(xì)胞尤其易受老齡化影響。Sartorelli等［22］觀察到捐精者年齡與精子染色體結(jié)構(gòu)畸變率呈極顯著正相關(guān)，在年長捐精者中可見高發(fā)生率的無著絲粒斷片及復(fù)雜放射體。利用精子FISH檢測，有研究發(fā)現(xiàn)1號染色體著絲粒缺失發(fā)生率與捐精者年齡顯著相關(guān)［23］，9號染色體著絲粒和亞端粒區(qū)域重復(fù)和缺失率隨年齡呈線性上升，每10年結(jié)構(gòu)畸變增加14.6%～28%［24］。Sloter等［25］報告年長男子（65～80歲）精子1號染色體片段重復(fù)及缺失率、1q12脆性位點(diǎn)區(qū)染色體斷裂率分別為22～28歲男子的2倍和1倍。運(yùn)用多色多染色體FISH方法，Templado等［26］發(fā)現(xiàn)年長男子所有精子常染色體結(jié)構(gòu)異常（重復(fù)與缺失）均顯著高于年輕男子（6.6%，4.9%），并證實(shí)無論年齡大小重復(fù)發(fā)生率均超過缺失（2：1）。對過多重復(fù)的可能解釋是其中某些新生異常來源于有絲分裂而非減數(shù)分裂重組或攜帶染色體缺失生殖細(xì)胞在精子發(fā)生期間的被動選擇。

2 精子DNA損傷

精子DNA完整性是正常受精和胚胎發(fā)育的重要決定因素之一。精子DNA損傷（DNA碎片、染色質(zhì)包裝異常及魚精蛋白缺陷）對自然受孕和輔助生殖技術(shù)治療結(jié)局具有負(fù)面影響［27-28］。大多數(shù)排出精液都含有攜帶DNA碎片的精子亞群。多項(xiàng)研究證實(shí)精子 DNA 碎片指數(shù)（DFI）隨年齡而上升［29-32］，精子前向活動率［29］、精子細(xì)胞凋亡［31］隨年齡而下降?！?5歲男子精子DFI為＜30歲男子的一倍（32.0%，15.2%）［33］，≥40歲男子嚴(yán)重精子 DNA損傷（DFI＞30%）的發(fā)生率幾乎為＜40歲男子的6倍（17%，3%）［29］。Wyrobek等［34］發(fā)現(xiàn)20～80歲之間精子DFI逐漸增高達(dá)5倍，無明顯年齡界限，認(rèn)為DFI上升是呈漸進(jìn)性的。也有研究報告年長男子射出的精子中早期凋亡生物標(biāo)記（漿膜磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)位）表達(dá)顯著升高［35］，并可見睪丸生殖細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白和凋亡標(biāo)記物的表達(dá)有顯著差異［36］。年齡相關(guān)的DNA斷裂增加和細(xì)胞凋亡失調(diào)的凈效應(yīng)造成更多缺陷精子排出。早期凋亡（或凋亡低表達(dá)）或有DNA損傷但形態(tài)正常的精子能夠有效受精，如果這些核苷酸或DNA損傷未被卵子修復(fù)，則可導(dǎo)致胚胎發(fā)育不良、流產(chǎn)以及其他不良生育結(jié)局［29，37-39］。盡管文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)并不完全一致，但支持精子DNA完整性隨年齡增長而下降的證據(jù)越來越多。

精子DNA損傷的機(jī)制包括精子發(fā)生過程中細(xì)胞凋亡失調(diào)、精子染色質(zhì)重構(gòu)期間生成DNA斷裂、精子經(jīng)生殖道運(yùn)行期間氧自由基（包括羥基自由基和一氧化氮）誘發(fā)睪丸后DNA碎片、內(nèi)源性凋亡蛋白酶及核酸內(nèi)切酶誘發(fā)DNA碎片、放療或化療以及環(huán)境毒物誘導(dǎo)DNA損傷等［40］。推測越來越多的氧化應(yīng)激可能在年齡相關(guān)的精子DNA損傷增加中起作用［12，29，41］。此外，錯配、堿基切除、核苷酸切除、雙鏈斷裂等修復(fù)效率可能受老齡化影響而改變，在年齡相關(guān)DNA損傷中起輔助促進(jìn)作用。

3 父親高齡與子代的遺傳風(fēng)險

父親高齡與自發(fā)先天性疾病和常見復(fù)雜疾?。ㄈ缒承┌┌Y、精神分裂癥、自閉癥等）風(fēng)險增高相關(guān)［4，11，42］，父親＞50歲，其子女發(fā)生軟骨發(fā)育不全（ACH）及 Apert、Pfeiffer、Crouzon綜合征的風(fēng)險分別為＜30歲父親的8～12倍、9.5倍、8倍及6倍；父親＞40歲，其子女發(fā)生自閉癥的風(fēng)險為＜30歲父親的5.75倍；父親≥50歲，其子女發(fā)生精神分裂癥的風(fēng)險為20～24歲男子的2.96倍［11］。受老齡化累及的表觀遺傳印跡改變也可能參與了高齡男子后代對多因素起源疾病的易感性［16，43］。

全基因組測序研究證實(shí)由父親傳代的突變數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于母親，父親年齡是決定突變率的主要因素［44-45］?？赡苁怯捎谀行陨臣?xì)胞周而復(fù)始增殖所經(jīng)歷的有絲分裂遠(yuǎn)多于女性，50歲時精原細(xì)胞（SSCs）分裂已達(dá)840次，而卵子發(fā)生的24次分裂在出生前已全部完成［46］。隨每一次細(xì)胞分裂，基因組復(fù)制都可能引入復(fù)制錯誤突變。其他年齡依賴因素，如DNA復(fù)制保真度降低、修復(fù)效率低下、或誘變劑反復(fù)暴露也可能參與了復(fù)制錯誤的累積。父親年齡與新生基因突變數(shù)量的正相關(guān)已得到若干常染色體和X染色體顯性遺傳疾病數(shù)據(jù)的支持［47］。

與父親高齡關(guān)聯(lián)最強(qiáng)的是FGFR2、FGFR3、RET、HIRAS及PTPN11基因中單堿基替換突變所導(dǎo)致的常染色體顯性疾病ACH、Apert、Pfiffer、Crouzon、Muenke、Costello及Noonan綜合征、以及2A和2B型多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤，這類疾病又被稱作父本年齡效應(yīng)（PAE）疾病，以極端父性突變起源偏向、顯著年齡影響及生殖細(xì)胞高突變率為特征［48］。除復(fù)制錯誤遞增假說，Goriely等［48］根據(jù)直接量化精子和睪丸內(nèi)PAE突變的證據(jù)，提出PAE是通過生長因子受體-RAS信號傳導(dǎo)通路分子介導(dǎo)的SSCs行為失調(diào)。PAE編碼突變蛋白賦予SSCs選擇優(yōu)勢，具有功能獲得性的突變SSCs在正常睪丸內(nèi)以類似腫瘤發(fā)生的過程被主動選擇和進(jìn)行性克隆擴(kuò)增［49］，這種"自私選擇"過程導(dǎo)致突變精子隨時間推移而富集。

與典型PAE疾病關(guān)聯(lián)的致病等位基因生殖適合度低下會被迅速淘汰，選擇優(yōu)勢較弱的中性和輕度致病突變則可能遺傳或累積數(shù)代，僅在突破一定“突變閾值”后影響后代健康。父親和祖父輩年齡可能助長子代的突變負(fù)荷，從而導(dǎo)致疾病風(fēng)險增高［50-53］。

高齡男子的精子經(jīng)歷更頻繁的年齡相關(guān)改變，可能導(dǎo)致各種后果，不僅對男子自身生育狀態(tài)，同時可能對其子女及數(shù)代人的健康和生存能力產(chǎn)生永久性影響。隨著父親年齡的增加，父性基因組新生突變的數(shù)量也在累加（每年新增2個突變）［44］。父親高齡被認(rèn)為是人類新生突變的主要原因。為減小高齡相關(guān)的風(fēng)險，一些國家將供精者年齡上限定為40歲，甚至30歲［54］。男子中年后（＞40歲）生育力下降、妊娠并發(fā)癥及生育罹患某種疾病子女的風(fēng)險增高似乎已成共識［5，41，55］。將準(zhǔn)備做父親的男子納入現(xiàn)有計劃生育和產(chǎn)前保健框架，向男、女雙方提供有關(guān)年齡對配子質(zhì)量影響的咨詢，有利于優(yōu)化妊娠結(jié)局。另外，不斷進(jìn)展的單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)［56-57］有望直接量化單個精子細(xì)胞攜帶的突變負(fù)荷，為體外受精植入前胚胎遺傳學(xué)診斷，以及母血中游離胎兒DNA產(chǎn)前篩查等提供了臨床應(yīng)用前景。

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