聯(lián)苯呋喃香豆素類衍生物BFD-6b 抗結(jié)腸癌作用的初步研究

李 軍，田秋梅，閆 蓉，郭 敏，吳方雄

（1. 陜西省森林工業(yè)職工醫(yī)院腫瘤二科，陜西西安 710300；2. 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710077）

結(jié)腸癌（colorectal cancer, CRC）是在結(jié)腸部位發(fā)生率很高的一種消化道惡性腫瘤，特別是在直腸與乙狀結(jié)腸相交的部位，40～50 歲之間結(jié)腸癌的發(fā)病率較高[1]。在胃腸道腫瘤發(fā)病率中結(jié)腸癌排第3 位[2]。目前，傳統(tǒng)手術(shù)仍然是結(jié)腸癌的主要治療方法，化學(xué)療法等作為輔助治療方法。然而，由于治療時(shí)間延長(zhǎng)、耐藥等其他不良反應(yīng)的發(fā)生，治療效果不佳[3]。因此，發(fā)掘傳統(tǒng)中藥資源，研究其對(duì)結(jié)腸癌的作用效果及其作用機(jī)制具有重要的科學(xué)和臨床意義。

細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)。細(xì)胞凋亡是一個(gè)多種基因參與調(diào)控、高度有序、細(xì)胞內(nèi)一系列酶級(jí)聯(lián)主動(dòng)參與的分子調(diào)控的過程[4]。凋亡的失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，凋亡不足可以引起如腫瘤及自身免疫病的發(fā)生，在腫瘤細(xì)胞中50%在凋亡機(jī)制上存在缺陷[5]。Bcl-2 家族分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。促凋亡蛋白質(zhì)主要包括Bax、Bcl-Xl、Bak 和Bad 等，抗凋亡蛋白質(zhì)則主要包括 Bcl-2、Bcl-XL 和Mcl-1 等。促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白之間可以相互作用，構(gòu)成一個(gè)相互制約的、相互作用的復(fù)雜精細(xì)的細(xì)胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6]。

大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞周期與其對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞周期相同，個(gè)別的甚至更長(zhǎng)，因此腫瘤是一種細(xì)胞周期的疾病[7]。通常在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，G1期是細(xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)期，這一時(shí)期細(xì)胞物質(zhì)代謝十分活躍，細(xì)胞體積較大，進(jìn)行RNA 與蛋白質(zhì)的合成[8]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）有20 多種亞型，包括 CDK1、CDK2、CDK4、CDK6 等；細(xì)胞周期蛋 白（cyclin）有 A、B、C、D、E、F 等 多 種 亞 型[9]。CDK、cyclin 以及二者復(fù)合物，與細(xì)胞的增殖和分化均有著密切的聯(lián)系[10]。

呋喃香豆素類化合物在許多天然產(chǎn)物中含量豐富，如白芷、當(dāng)歸等。研究發(fā)現(xiàn)，其具有各種藥理活性，如抗炎鎮(zhèn)痛、抗凝血、抗心律失常、抗腫瘤作用等[11]。BFD-6b（圖1）是一種新型的聯(lián)苯呋喃香豆素類化合物，其聯(lián)苯結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)使得化合物具有血管舒張作用，叔胺側(cè)鏈的引入提高水溶性，優(yōu)化其理化性質(zhì)[12]。本研究中，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)、藥物干預(yù)、MTT、流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡等方法，考察BFD-6b對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。

圖1 BFD-6b 分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structural formula of BFD-6b

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Amresco 公司，噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，注射用青、鏈霉素購(gòu)自陜西先鋒生物有限公司，UItraSingna 超敏ECL 化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自正四柏生物有限公司，脫脂奶粉購(gòu)自伊利，PI 雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及免疫印跡實(shí)驗(yàn)所用抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech，1640 培養(yǎng)基購(gòu)自上海培源生物科技股份有限公司，胰酶購(gòu)自Solarbio，PBS 購(gòu)自上海培源生物科技股份有限公司，Tween20購(gòu)自PIONEER。

1.2 細(xì)胞株

細(xì)胞株（SW480、MCF-7、HELA、H1299、H460、MHCC-97H、A549、MS751、BEL-7402、SMMC-7721、SK-HEP-1、T47D、SW620、Lovo、HCT116）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。細(xì)胞在37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下的孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取不同的細(xì)胞株，比較BFD-6b 對(duì)不同種類細(xì)胞增殖的影響。將細(xì)胞接種于 96 孔板（180 μL/孔），放置 37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)24 h。次日加入用無血清無雙抗的培養(yǎng)基配制的8 個(gè)濃度梯度（0.39 μmol/L、0.78 μmol/L、1.56 μmol/L、3.12 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L）的 待 測(cè) 藥 品BFD-6b，每個(gè)濃度設(shè)置10 個(gè)復(fù)孔。陰性對(duì)照：等量培養(yǎng)基未加藥；空白對(duì)照：等量無細(xì)胞且無血清無雙抗的培養(yǎng)基。加完藥后放于37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h 后取出孔板，在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行操作，小心吸出每個(gè)孔中的培養(yǎng)基，加入配制好的 MTT 溶液（200 μL/孔）。在 37 ℃，50 mL/L CO2飽和濕度孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，4 h 后將96 孔板中培養(yǎng)基吸干凈，每孔加入DMSO 150 μL，在搖床上使其混合均勻（15 min）。使用超微量分光光度計(jì)在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。

1.3.2 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，接種細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分別標(biāo)注陰性、小濃度（1.56 μmol/L）、中濃度（3.12 μmol/L）、高濃度（6.25 μmol/L），放置37 ℃孵育箱中培養(yǎng)48 h，次日加藥。將細(xì)胞消化后收集到10 mL EP 管中，離心（5 min，1 000 r/min），棄去培養(yǎng)液，加預(yù)冷的 PBS 清洗，離心（5 min，1 000 r/min）。每個(gè)EP 管中加入1 mL 預(yù)冷的700 mL/L 乙醇，在-20 ℃中放置 2 h，離心（5 min，1 000 r/min），小心吸去乙醇后，每管加入1 mL PBS，離心（5 min，1 000 r/min），棄上清液。室溫條件下每管加 1 mL RNA 酶（避光操作），反應(yīng) 30 min 后離心（5 min，1 000 r/min），吸出上清液。每管加入PBS（500 μL），以及PI（25 μL）染色，使用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)（避光操作）。

1.3.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，接種細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分別標(biāo)注陰性、小濃度（1.56 μmol/L）、中濃度（3.12 μmol/L）、高濃度（6.25 μmol/L），放置37 ℃孵育箱中培養(yǎng)48 h，次日加藥。將細(xì)胞消化后收集到10 mL EP 管中，離心（5 min，1 000 r/min），棄去培養(yǎng)液，加預(yù)冷的PBS 清洗，離心（5 min，1 000 r/min）。按照凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行PI 和Annexin V-FITC 雙染色。在4 ℃下避光孵育20 min 后用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。

1.3.4 蛋白免疫印跡分析 待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，接種細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分別標(biāo)注陰性、小濃度（1.56 μmol/L）、中濃度（3.12 μmol/L）、高濃度（6.25 μmol/L），放置37 ℃孵育箱中培養(yǎng)48 h，次日加藥。用PBS 清洗細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液（10%蛋白酶抑制劑∶10%磷酸酶抑制劑∶80% RIPA=8∶1∶1 體積比），在4 ℃條件下裂解30 min。用刮刀將培養(yǎng)皿底的細(xì)胞刮干凈，移至1.5 mL EP管中。使用細(xì)胞超聲破碎儀破碎細(xì)胞，共6次，每次3 s（冰上)，完成后，冷凍離心機(jī)離心（12 000 r/min，10 min，4 ℃），吸取上清液。加入適量5×loading buffer（上清液∶5×loading buffer=4∶1），加熱煮沸5 min 使蛋白變性。將蛋白樣品上樣分析，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，使用脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗后，4 ℃條件下過夜。然后孵育二抗（37 ℃，30 min），之后進(jìn)行顯影。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析由SPSS 軟件（14.0，芝加哥，美國(guó)）來計(jì)算。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（）來表示，用 One-way ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BFD-6b 對(duì)不同癌癥細(xì)胞增殖的抑制作用

由 圖 2 可 知 ，BFD-6b 對(duì) SW480、MCF-7、HELA、H1299、H460、A549 等腫瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用，而對(duì) A549、MS751、BEL-7402、SMMC-7721、SK-HEP-1、T47D 細(xì) 胞 增 殖 影 響 不 明 顯 。BFD-6b 對(duì)SW480 作用最強(qiáng)，效果最明顯，所以選取SW480 作為初步研究的細(xì)胞株。BFD-6b 對(duì)SW480細(xì)胞增殖具有較好的抑制作用，且呈濃度依賴性，其IC50值為 7.09 μmol/L。

圖2 BFD-6b 對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effect of BFD-6b on cell proliferation (n=3)

由上可知，BFD-6b 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，因此本研究又選取了幾種結(jié)腸癌細(xì)胞，考察BFD-6b 對(duì)結(jié)腸癌的增殖抑制作用。由圖3A 可知，BFD-6b 對(duì) SW620、Lovo、HCT116 細(xì)胞增殖均有較強(qiáng)的抑制作用，且呈濃度依賴性，其IC50值分別為7.23、8.08、8.96 μmol/L。由此可見，BFD-6b 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞均具有明顯的抗腫瘤作用，因SW480 細(xì)胞對(duì)其最為敏感，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇SW480 作為研究對(duì)象。圖3B 結(jié)果表明，BFD-6b 對(duì)SW480 細(xì)胞增殖不僅具有量效關(guān)系，同時(shí)具有時(shí)間依賴關(guān)系，其作用SW480 細(xì)胞 24、48、72 h 的 IC50值分別為＞50、7.09、5.86 μmol/L。

圖3 BFD-6b 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The effect of BFD-6b on cell proliferation (n=3)

2.2 BFD-6b 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 凋亡的影響

為了進(jìn)一步了解BFD-6b 對(duì)SW480 增殖的影響，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC/PI 雙染，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BFD-6b 對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。由圖4 可知，BFD-6b對(duì)SW480細(xì)胞具有明顯誘導(dǎo)凋亡的作用，并且隨著藥物濃度的遞增，細(xì)胞凋亡率增多。當(dāng)BFD-6b的作用濃度分別為 0、1.56、3.12、6.25 μmol/L 時(shí)，SW480細(xì)胞的凋亡率為4.94%、9.42%、11.35%及27.81%。

圖4 BFD-6b 對(duì)SW480 細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 The effect of BFD-6b on SW480 cell apoptosis (n=3)

2.3 BFD-6b 對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting 的方法考察BFD-6b 作用于SW480 細(xì)胞后對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，BFD-6b 作用于SW480 細(xì)胞后，明顯下調(diào)抑凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2 的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白BAK、BAX 表達(dá)（圖 5）。

圖5 BFD-6b 對(duì)SW480 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The effect of BFD-6b on the expressions of cell apoptotic-related proteins (n=3)

2.4 BFD-6b 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 周期的影響

為了探究BFD-6b 抑制SW480 增殖的作用機(jī)制，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測(cè)BFD-6b 對(duì)細(xì)胞周期變化的影響。由圖6 可知，BFD-6b 對(duì)SW480 周期變化有明顯影響，隨著藥物濃度增大，G1期細(xì)胞逐漸增多，分別為50.39%（陰性）、52.41%（1.56 μmol/L）、55.73%（3.12 μmol/L）、67.16%（6.25 μmol/L）。表明BFD-6b可阻滯細(xì)胞于G1期，從而延長(zhǎng)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。

圖6 BFD-6b 對(duì)SW480 細(xì)胞周期的影響Fig.6 The effect of BFD-6b on SW480 cell cycle (n=3)

2.5 BFD-6b 對(duì)周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting 的方法考察BFD-6b 作用于SW480 細(xì)胞后對(duì)周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示；BFD-6b 作用于SW480 細(xì)胞后，明顯下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinE、cyclinD1 以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDC2 的表達(dá)（圖7）。

圖7 BFD-6b 對(duì)SW480 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.7 The effect of BFD-6b on the expressions of cell cycle-related proteins (n=3)

3 討 論

結(jié)腸癌是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，隨著人們生活水平的提高，發(fā)病率逐年增加[13]。前期報(bào)道歐前胡素具有抗腫瘤作用，為了進(jìn)一步研究，本團(tuán)隊(duì)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化，得到了其衍生物BFD-6b，進(jìn)而進(jìn)行BFD-6b 抗結(jié)腸癌作用初步研究。本研究中采用MTT 法進(jìn)行初篩后，結(jié)果顯示 BFD-6b 對(duì) SW480 細(xì)胞增殖抑制效果最強(qiáng)，且呈濃度依賴性。同時(shí)，BFD-6b 對(duì) SW620、Lovo、HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞增殖均有較強(qiáng)的抑制作用，且呈濃度依賴性。因SW480 細(xì)胞對(duì)其最為敏感，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇SW480作為研究對(duì)象。

凋亡過程的紊亂可能與腫瘤的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系，由于腫瘤細(xì)胞無法對(duì)其生長(zhǎng)進(jìn)行正常調(diào)控，導(dǎo)致異常增殖[14]。本研究結(jié)果顯示，BFD-6b 可有效誘導(dǎo)SW480 細(xì)胞凋亡，且隨給藥濃度增加，細(xì)胞凋亡的比例依次上升。Bcl-2 蛋白家族是細(xì)胞凋亡相關(guān)內(nèi)源性線粒體通路的關(guān)鍵蛋白，主要包括促凋亡蛋白 BAX、BAK 等和抗凋亡蛋白 Bcl-2 和 Mcl-1 等。本研究免疫印跡結(jié)果表明，BFD-6b 可下調(diào)抑凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2 的表達(dá)量，上調(diào)促凋亡蛋白BAK、BAX 表達(dá)量從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期是一次細(xì)胞分裂完成到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束的整個(gè)過程，包括G1期、S 期、G2期。調(diào)控參與細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白，能夠使腫瘤細(xì)胞的活性得到抑制，并進(jìn)一步阻滯腫瘤細(xì)胞的無限增殖，達(dá)到治療腫瘤的目的[15]。本研究結(jié)果顯示，BFD-6b 對(duì)SW480 周期變化有明顯影響，隨著藥物濃度增大，G1期細(xì)胞逐漸增多，表明BFD-6b可阻滯細(xì)胞于G1期，從而延長(zhǎng)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。cyclinD1 為G1期進(jìn)展的限速調(diào)節(jié)因子，cyclinD1 表達(dá)水平下降，可阻滯細(xì)胞于G1期；cyclinE 是細(xì)胞周期從G1期轉(zhuǎn)向S 期的重要蛋白，其表達(dá)量減少可阻滯細(xì)胞由G1期進(jìn)入S 期；CDC 可以與 cyclinA 和 cyclinB 結(jié)合控制 S 期到 G2期和 G2期到M 期兩個(gè)控制點(diǎn)，因此CDC 表達(dá)減少，抑制細(xì)胞從S 期到G2期和G2期到M 期。本研究蛋白免疫印跡結(jié)果表明，BFD-6b 可下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinD1、cyclinE 以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDC2 的表達(dá)量，從而將細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖。

綜上，BFD-6b 作用于SW480 細(xì)胞通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinD1、cyclinE 以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDC2 蛋白表達(dá)，阻滯SW480 細(xì)胞于G1期；同時(shí)通過下調(diào)抑凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2 蛋白表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白BAK、BAX 蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 的增殖。