羊口瘡病毒鳳翔株ORFV121和vIL－10基因的生物信息學(xué)分析

劉 方，趙玄多，安 貝，劉 慧，高 洋，張立強(qiáng)，賈蕓曉，陳德坤

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

羊口瘡病毒鳳翔株ORFV121和vIL－10基因的生物信息學(xué)分析

劉 方，趙玄多，安 貝，劉 慧，高 洋，張立強(qiáng)，賈蕓曉，陳德坤＊

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

為分析羊口瘡病毒ORFV121和vIL－10基因在鳳翔（FX0910）強(qiáng)毒株（v ORFV）和弱毒株（lvORFV）之間的差異，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增羊口瘡病毒ORFV121和vIL－10基因的全長(zhǎng)序列并測(cè)序，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析基因的核酸、氨基酸相似性，蛋白的親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及抗原性。結(jié)果顯示，lv ORFV的ORFV121基因118位的谷氨酸缺失，說(shuō)明該處發(fā)生的堿基突變?yōu)橛幸馔蛔?，該突變?dǎo)致弱毒株相應(yīng)蛋白的親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白的抗原性在很多區(qū)域發(fā)生本質(zhì)改變；vIL－10在蛋白質(zhì)水平出現(xiàn)了5個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變（14：V→W，49：A→P，57：T→M，72：R→C，102：I→V）和79位插入1個(gè)色氨酸。這些位點(diǎn)差異導(dǎo)致蛋白的親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原性發(fā)生了變化。ORFV121基因和vIL－10基因在v ORFV和lv ORFV之間存在差異，這些基因差異導(dǎo)致蛋白的親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原性發(fā)生改變。

羊口瘡病毒鳳翔株；ORFV121；vIL－10；基因差異

羊口瘡（Orf）又稱(chēng)羊傳染性膿皰皮炎（Contagious pustular dermatitis），是由羊口瘡病毒（Orf virus，ORFV）引起的一種急性、接觸性、嗜上皮性人獸共患傳染?。?］。主要感染綿羊和山羊，綿羊比山羊更易感，羔羊和小羊比成年羊更易感［2］。該病在成年羊中表現(xiàn)為高發(fā)病率（90%）和低病死率（＜10%）［3］，在羔羊和小羊中表現(xiàn)為高發(fā)病率和高死亡率，發(fā)病率可達(dá)100%，病死率可達(dá)93%［4］，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究人員發(fā)現(xiàn)了更多的羊口瘡病毒地方株，但這些毒株之間存在不同程度的基因差異［5－8］，并有報(bào)道指出不同毒株間不能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)［9］。而我國(guó)現(xiàn)有的羊口瘡疫苗為20世紀(jì)90年代甘肅畜牧獸醫(yī)研究所研制的羊口瘡弱毒疫苗，該疫苗現(xiàn)在已經(jīng)不能對(duì)羊口瘡起到良好的預(yù)防作用。

隨著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，羊口瘡已成為影響?zhàn)B羊業(yè)的主要疾病之一［10－11］，亟需要一種免疫保護(hù)率高的羊口瘡疫苗。因此，需要對(duì)羊口瘡強(qiáng)、弱毒株間基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)強(qiáng)、弱毒株間基因結(jié)構(gòu)及功能的差異，找出與病毒毒力和免疫保護(hù)功能相關(guān)的基因，為利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)羊口瘡病毒進(jìn)行基因改造，制備免疫保護(hù)率高的疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病毒、載體和宿主細(xì)胞 原核克隆載體p GEM－Teasy為Promega公司產(chǎn)品；羊口瘡病毒鳳翔株強(qiáng)毒株（virulent ORFV－FX0910，vORFV）和弱毒株（low virulent ORFV－FX0910，lv ORFV）、感受態(tài)細(xì)胞HD－5α，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1．1．2 主要試劑 rTaqDNA ploymerase、T4 DNA連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Trans DNA MarkerⅠ為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上已經(jīng)提交的羊口瘡病毒ORFV121、vIL－10基因序列，用Primer Premier 5．0設(shè)計(jì)2對(duì)引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為440 bp和912 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1．2．2 ORFV121、vIL－10基因PCR擴(kuò)增 取本實(shí)驗(yàn)室保存的v ORFV和lvORFV細(xì)胞培養(yǎng)液100μL，在沸水中煮沸5 min，冰水冷卻3 min，1 000 r／min離心5 min，取上清為PCR擴(kuò)增模板。PCR反應(yīng)程序如下：94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃10 min。取PCR產(chǎn)物用20 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后按照DNA膠回收試劑盒說(shuō)名書(shū)回收PCR產(chǎn)物。

1．2．3 ORFV121、vIL－10基因克隆、測(cè)序 將膠回收產(chǎn)物與p GEM－Teasy鏈接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，從含有氨芐青霉素的平板中挑取單克隆用于質(zhì)粒PCR鑒定，陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1．2．4 生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果用DNA Star軟件整理后用Blast檢測(cè)序列是否正確，用Clone Manager進(jìn)行核酸相似性和氨基酸相似性分析，DMA Man分析蛋白親水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)，DNA Star分析抗原性分析。

2 結(jié)果

2．1 ORFV121、vIL－10基因PCR擴(kuò)增

分別用引物擴(kuò)增vORFV和lvORFV的OFFV121和vIL－10基因，擴(kuò)增后ORFV121基因在900 bp、vIL－10基因在450 bp左右各有一條特異性條帶，與ORFV121基因的片段大小912 bp和vIL－10基因的片段大小440 bp基本相符（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增vIL－10和ORFV121基因Fig．1 PCR amplication of vIL－10 and ORFV121 genes

2．2 基因克隆、鑒定

挑取單克隆，過(guò)夜培養(yǎng)提取質(zhì)粒，以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與目的片段大小相符的特異性條帶，證明該質(zhì)粒中含有欲克隆基因（圖2）。將測(cè)序結(jié)果用DNA Star處理后進(jìn)行Blast比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果顯示克隆基因與設(shè)計(jì)一致，表明成功克隆了ORFV－FX0910強(qiáng)、弱毒株的ORFV121基因和vIL－10基因。

圖2 p GEM－T easy－vIL－10和p GEM－T easy－ORFV121重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig．2 PCR identification of recombinant pGEM－T easy－vIL－10 and p GEM－T easy－ORFV121

2．3 ORFV121、vIL－10基因的核酸相似性和氨基酸相似性分析

用Clone Mnager分析ORFV121和vIL－10基因的核酸相似性和氨基酸相似性。結(jié)果表明，v ORFV中存在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，即118位的谷氨酸缺失（圖3）。強(qiáng)、弱毒株間vIL－10基因在蛋白質(zhì)水平存在6個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，具體見(jiàn)表2、圖4。

表2 vIL－10基因突變情況Table 2 Gene mutation of vIL－10

圖3 ORFV－FX0910強(qiáng)、弱毒株間ORFV121基因核酸相似性和氨基酸相似性分析Fig．3 Similarity analysis of gene and amino acid of ORFV121 between vORFV and lvORFV

圖4 ORFV－FX0910強(qiáng)、弱毒株間vIL－10基因核酸相似性和氨基酸相似性分析Fig．4 Similarity analyses of nucleic acids and amino acids of vIL－10 gene between vORFV and lvORFV

2．4 ORFV121、vIL－10蛋白親水性分析

經(jīng)DNA Man軟件分析，ORFV121蛋白大部分區(qū)域?yàn)橛H水性結(jié)構(gòu)，vIL－10蛋白大部分區(qū)域?yàn)槭杷越Y(jié)構(gòu)。與強(qiáng)毒株相比，弱毒株中ORFV121蛋白由于118位谷氨酸缺失，其后的氨基酸親水性發(fā)生相對(duì)變化。對(duì)于vIL－10，由于弱毒株中存在6個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，蛋白的親水性發(fā)生很大變化，特別是70位～80位氨基酸這段區(qū)域，蛋白的親水性發(fā)生了本質(zhì)改變（圖5）。

圖5 強(qiáng)、弱毒株間ORFV121、vIL－10蛋白親水性分析Fig．5 The analyes of hydophilicity for ORFV121 and vIL－10 between vORFV and lvORFV

2．5 ORFV121、vIL－10蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

用DNA Man預(yù)測(cè)ORFV121和vIL－10蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。ORFV121的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示lv ORFV 118位氨基酸附近的螺旋結(jié)構(gòu)消失，有可能突變?yōu)榫砬Y(jié)構(gòu)。vIL－10二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，弱毒株中存在較多的二級(jí)結(jié)構(gòu)位點(diǎn)差異，特別是36位～72位氨基酸間二級(jí)結(jié)構(gòu)差異最多，其中57位氨基酸附近的折疊結(jié)構(gòu)消失，可能突變?yōu)榫砬Y(jié)構(gòu)。110位的折疊結(jié)構(gòu)突變?yōu)榫砬Y(jié)構(gòu)，但該位點(diǎn)沒(méi)有堿基突變，說(shuō)明堿基突變導(dǎo)致蛋白其他部位的二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了本質(zhì)變化（圖6）。

2．6 ORFV121、vIL－10蛋白抗原性分析

用DNA Star中的Protean預(yù)測(cè)ORFV121和vIL－10蛋白的抗原性。ORFV121蛋白的抗原性分析表明，vORFV中絕大部分區(qū)域抗原指數(shù)很高，但lv ORFV中只有少部分區(qū)域抗原指數(shù)較高，說(shuō)明lvORFV中ORFV121蛋白的抗原性較差。強(qiáng)、弱毒株間vIL－10蛋白絕大部分的抗原指數(shù)相同，只有部分區(qū)域的抗原指數(shù)發(fā)生了變化，說(shuō)明強(qiáng)、弱毒株間vIL－10蛋白的抗原性未發(fā)生太大變化（圖7）。

3 討論

本研究所用lv ORFV已通過(guò)動(dòng)物安全性試驗(yàn)證明其毒力已經(jīng)人工致弱，不具有致病性，不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生臨床病變。動(dòng)物免疫試驗(yàn)證明該弱毒株免疫保護(hù)效果好，保護(hù)率可達(dá)90%［12］。

ORFV121通過(guò)編碼一種特異性病毒NF－κB信號(hào)通路抑制物，能夠結(jié)合NF－κB p65并抑制 NF－κB p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制NF－κB信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞凋亡［13－14］。在 ORFV121基因突變或者缺失的情況下，細(xì)胞凋亡抑制作用減弱或消失，病毒感染宿主后，可迅速被機(jī)體識(shí)別和清除。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，野毒株感染的羊群會(huì)長(zhǎng)期帶毒，但是用lvORFV免疫羊群后，其帶毒時(shí)間不會(huì)超過(guò)2個(gè)月。說(shuō)明羊口瘡病毒凋亡抑制作用的減退可能與ORFV121基因118位谷氨酸缺失有關(guān)。

羊口瘡病毒編碼的vIL－10具有免疫抑制作用，能夠抑制巨噬細(xì)胞和角蛋白細(xì)胞分泌TNF－α和IL－8及活化的淋巴細(xì)胞分泌IFN－γ［15］。lv ORFV 中vIL－10基因發(fā)生突變和缺失，可能導(dǎo)致vIL－10的免疫抑制作用減輕或者消失，感染羊群后，宿主的抗感染免疫被迅速激發(fā)，病毒被快速清除。也有研究指出ORFV毒力致弱可能與vIL－10 87位的氨基酸突變有關(guān)［15］，但本研究中87位的氨基酸未發(fā)生突變，說(shuō)明ORFV－FX0910毒力弱化與87為氨基酸是否突變關(guān)系不大。

圖6 ORFV－FX0910強(qiáng)、弱毒株中ORFV121和vIL－10蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig．6 Analyses of secondary structure of ORFV121 and vIL－10 proteins between vORFV and lvORFV

圖7 vORFV和lvORFV之間ORFV121和vIL－10抗原性分析Fig．7 Antigenic analyses for ORFV121 and vIL－10 of ORFV－FX0910 between virulent and low virulwnt strains

本研究通過(guò)克隆vORFV和lvORFV中的ORFV121基因和vIL－10基因的全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析表明v ORFV和lvORFV之間ORFV121基因和vIL－10基因存在差異，這些基因差異導(dǎo)致蛋白的親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原性發(fā)生改變。這些研究結(jié)果為利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)羊口瘡病毒進(jìn)行基因改造，制備免疫保護(hù)率高的疫苗提供理論依據(jù)。

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Bioinformatics Analyses ORFV121 Gene and vIL－10 Gene of ORFV－FX0910 Strain

LIU Fang，ZHANO Xuan－duo，AN Bei，LIU Hui，GAO Yang，ZHANG Li－qiang，JIA Yun－xiao，CHEN De－kun

（CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA＆FUniversity，Yangling，Shaanxi，712100，China）

Abstruct：In order to analyse the diffenences in ORFV121 gene and vIL－10 gene between the virulent and low virulent strains of ORFV－FX0910．The full lengths of the two genes were abtained by the method of PCR amplification and then for sequencing．The similarities of nucleic acids，amino acids，hydrophilicities，secondary structures，and antigenicities of proteins were analyzed using bioinformatics software．The results showes that，there was a glutamic deletion at site 118 of ORFV121 in the lvORFV，which suggested the corresponding base mutation was significant．As a result，hydrophilicity and secondary structure were changed，and antigenicity was changed essentially at many domains of the ORFV121 protein．For vIL－10 protein，there were 5 amino acid mutations（14：V→W，49：A→P，57：T→M，72：R→C，102：I→V）and one tryptophan insertion at site 79，which resulting in the variations of hydrophilicity，secondary structure，and antigenicity．In conclusion，there were differnences in ORFV121 gene and vIL－10 gene between v ORFV and lv ORFV，and the hydrophilicities，secondary structures，and antigenicities of proteins were changed due to these mutations．

ORFV－FX0910；ORFV121；vIL－10；genetic variation

S852．659．1

A

1007－5038（2014）07－0052－07

2014－03－27

陜西省科技統(tǒng)籌新工程計(jì)劃項(xiàng)目（2013KTZB02－02－02，2013KTZB02－02－03）

劉 方（1987－），女，陜西渭南人，碩士研究生，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。＊通訊作者