DNA甲基化及測定方法

史雙林

(北華大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

在真核生物中，甲基化只發(fā)生在胞嘧啶第五位碳原子上，由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化，以S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)的一種反應(yīng)。其可保護(hù)DNA不被限制性內(nèi)切酶切開。在人類基因組中，DNA的胞嘧啶約有4％被甲基化，它與基因表達(dá)有重要關(guān)系?；钚匀旧|(zhì)DNA呈低甲基化。60％～90％ CpG二核苷酸的胞嘧啶是甲基化的，主要散布在DNA重復(fù)序列。管家基因和組織特異性基因的5′端，啟動(dòng)子和第一個(gè)外顯子區(qū)，由CpG密集(C+G>50％)而成，長度為1 000～2 000 bp，稱為CpG島，通常是非甲基化的，其甲基化可抑制轉(zhuǎn)錄，基因靜默。DNA甲基化與研究在非DNA序列改變的修飾，影響基因表達(dá)的可遺傳的表觀遺傳學(xué)密切相關(guān)。其與組蛋白乙?；诨虮磉_(dá)調(diào)控中的作用，與腫瘤、衰老、分化等一系列醫(yī)學(xué)生物學(xué)問題有關(guān)〔1～4〕。

1 DNA甲基化

1.1DNA甲基化譜的建立 DNA甲基化分為2種：維持甲基化和從頭甲基化。維持甲基化是當(dāng)甲基化的雙鏈DNA復(fù)制后，在DNMT1作用下，生成的兩條新鏈中，只有親代鏈?zhǔn)羌谆?，而新合成的子代鏈?zhǔn)欠羌谆?。DNA整體甲基化主要與DNMT1相關(guān)，對生物DNA甲基化表型起維持作用。從頭甲基化則是在完全去甲基化的位點(diǎn)引入甲基，在從頭甲基化酶DNMT3a和DNMT3b催化下，建立甲基化機(jī)制。在早期胚胎和胚胎期腫瘤(EC)的細(xì)胞中，DNMT1完全失活，基因組完全去甲基化，此后DNMT3a和DNMT3b催化下，基因組開始重建甲基化譜。其建立過程就是細(xì)胞分化的完成過程，也是細(xì)胞部分或完全喪失分裂能力的過程。具有組織特異性，甲基化譜不同的細(xì)胞其功能也不同〔1〕。

1.2DNA甲基化可改變DNA構(gòu)象，影響蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合 DNA甲基化后由于甲基在DNA雙螺旋深溝中暴露在外，改變了DNA的構(gòu)象，影響其與蛋白質(zhì)分子的相互作用，呈空間位阻效應(yīng)。DNA通常以B型狀態(tài)存在，右手螺旋。當(dāng)高度甲基化時(shí)，以Z型狀態(tài)存在，左手螺旋，比B型較為細(xì)長。Z-DNA的抗原性較強(qiáng)，可以免疫家兔制備抗體。利用Z-DNA抗體即可檢測Z-DNA的存在〔2，3〕。

基因啟動(dòng)子部位甲基化使甲基-CpG結(jié)合蛋白(MeCPs)附著，從而直接妨礙啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子(Sp1，E2F)，核因子(NF)-κB等結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄。1989年在細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)了與DNA甲基化有特異親和力的蛋白質(zhì)MeCP1，它可以識別至少12個(gè)或更多對稱性的CpG位點(diǎn)形成復(fù)合體。為一個(gè)大的多亞單位復(fù)合物，其中結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了復(fù)合物與DNA甲基化的識別。隨后發(fā)現(xiàn)了結(jié)合單一CpG位點(diǎn)的MeCP2，有特異性，比MeCP1豐度高。MeCP2有兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)域：一是甲基化CpG MBD，與啟動(dòng)子甲基化CpG結(jié)合；另一個(gè)是轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(TRD)，可招集轉(zhuǎn)錄抑制子(Sin3)和組蛋白去乙?；?HDAC)，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，抑制轉(zhuǎn)錄〔3～5〕。

組蛋白乙?；l(fā)生在核小體八聚體組蛋白N末端，即堿性氨基酸殘基集中區(qū)，使賴氨酸殘基ε-NH2帶上正電荷，組蛋白和DNA之間的靜電引力減弱，降低親和力，有利染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄起始。組蛋白共價(jià)修飾(乙酰化、 甲基化、磷酸化等)、DNA甲基化、轉(zhuǎn)基因等機(jī)制在不同的基因調(diào)控中，彼此之間相互影響，形成“串話”，并按照一定的順序發(fā)揮作用〔6，7〕。

在DNA甲基化研究了60多年后，進(jìn)入本世紀(jì)才確定了其在人類疾病的重要作用。Rett綜合征(RS)是一種嚴(yán)重影響兒童精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育的疾病，(1～2.2)萬女嬰中散發(fā)1例。MeCP2基因突變是RS致病的分子基礎(chǔ)，MeCP2基因位于人類染色體(Xq28)，轉(zhuǎn)錄翻譯生成MeCP2蛋白，此蛋白通過調(diào)控腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)而影響神經(jīng)元可塑性，進(jìn)而引起腦發(fā)育障礙、記憶、認(rèn)識、運(yùn)動(dòng)功能落后。BDNF基因有4個(gè)啟動(dòng)子，在其表達(dá)前后MeCP2結(jié)合在BDNF啟動(dòng)子Ⅲ上游-150的甲基化位點(diǎn)抑制啟動(dòng)子Ⅲ，如果MeCP2蛋白突變則BDNF基因表達(dá)受到抑制〔8，9〕。

1.3DNA甲基化與基因印記、X-染色體失活、脆性X染色體綜合征密切相關(guān) 哺乳動(dòng)物，子代基因分別來自父、母的2個(gè)等位基因，活性不同。胰島素樣生長因子(Igf)2來自父本的等位基因表達(dá)良好，來自母本的等位基因無活性，不表達(dá)。這種現(xiàn)象稱為基因印記。Igf2基因?yàn)槟冈从∮?，父源表達(dá)。因?yàn)樵诟冈催z傳中，鼠7號染色體Igf2基因下游的印跡控制區(qū)(ICR)蛋白結(jié)合位點(diǎn)被甲基化不能結(jié)合特異蛋白(CTCF)，失去阻礙作用，使下游的增強(qiáng)子可越過ICR直接激活遠(yuǎn)端的Igf2基因。也可相反，例如H19基因是父源印記，母源表達(dá)〔10，11〕。

X染色體很大，含有全部DNA的6％，Y染色體通常很小。盡管男性僅有一條X染色體，但是編碼的基因產(chǎn)物如紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)活性平均量與有兩條X染色體的女性相同。但在此酶缺欠的個(gè)體中，男性患者多于女性。因此，肯定存在某種劑量補(bǔ)償機(jī)制。正常雌性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中，2條X染色體中有1條上的大多數(shù)基因在遺傳表達(dá)上是失活的。X失活發(fā)生在胚胎早期，是隨機(jī)的(可來自父本或母本)。X失活是廣泛的，X染色體上1/3的基因可能逃避。多數(shù)體細(xì)胞X失活是永久的，但在生殖細(xì)胞發(fā)育中，必須是可逆轉(zhuǎn)的。其機(jī)制涉及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，包括DNA差異性甲基化和組蛋白乙?；Ｔ谑Щ頧染色體上，沉默基因5′上游區(qū)域內(nèi)的CpG島高度甲基化，而染色體上的同源序列則是非甲基化的〔12〕。

脆性X染色體綜合征患者染色體上發(fā)現(xiàn)有1個(gè)葉酸敏感位點(diǎn)。(FMR)1基因，即脆性X染色體智力低下基因，位于Xq27.3，長38 kb，包含17個(gè)外顯子，可能編碼一種RNA結(jié)合蛋白。在非翻譯的第1外顯子內(nèi)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)CGG三核苷酸的重復(fù)序列，正常情況下其長度為6～50個(gè)重復(fù)次數(shù)，平均為30。在此癥受累患者中，這種CGG重復(fù)極度擴(kuò)展至幾百甚至幾千。當(dāng)重復(fù)次數(shù)超過大約230時(shí)，F(xiàn)MR1基因5′端高度甲基化，轉(zhuǎn)錄關(guān)閉。FMR1 mRNA和蛋白質(zhì)的缺乏被認(rèn)為是造成這種綜合征臨床表現(xiàn)的原因。

1.4DNA甲基化與衰老的關(guān)系 基因組總體低甲基化，局部高甲基化是衰老時(shí)DNA甲基化的典型表現(xiàn)。這與DNA甲基化酶總活性降低有關(guān)。衰老可影響DNA甲基化，DNA甲基化也可影響衰老。某些基因啟動(dòng)子的CpG島甲基化增高。測定體外培養(yǎng)的人二倍體成纖維細(xì)胞，小鼠細(xì)胞中DNA的5mC的含量，結(jié)果均表明其甲基化程度隨細(xì)胞代數(shù)的增高而降低，而且細(xì)胞5mC丟失的速率與其壽限(可傳代齡)密切相關(guān)〔2〕。

衰老時(shí)DNA甲基化變化具有不均一性。檢測不同代齡人成纖維細(xì)胞DNA的衛(wèi)星(Sat)2和Sat 3的甲基化狀態(tài)，結(jié)果表明：Chr1、Chr 9和Chr 16的近著絲粒異染色質(zhì)富含Sat2和Sat3。Sat3的DNA甲基化降低速度比Sat2和總體DNA快2倍。他們認(rèn)為這種降低可增加染色體重排的可能性，這種染色體不穩(wěn)定性是復(fù)制性衰老的原因之一〔2〕。

DNMT1抑制劑5-雜氮-2脫氧胞苷酸和5-雜氮胞苷酸，為胞嘧啶衍生物，可降低DNA甲基化水平，促進(jìn)衰老。

1.5DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系 腫瘤細(xì)胞中常有DNA整體甲基化水平下降，主要是重復(fù)序列的去甲基化，導(dǎo)致整個(gè)基因組不穩(wěn)定及特定序列高甲基化并存的現(xiàn)象，這與異常的DNMT有關(guān)。一些癌基因通過去甲基化而被激活；一些抑癌基因啟動(dòng)子CpG島高甲基化使其失活，誘發(fā)癌癥。高度、中度重復(fù)DNA序列低甲基化，包括異染色質(zhì)的衛(wèi)星DNA LINE-1，人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(HERV)-K家族，NBL1等。在慢性淋巴細(xì)胞白血病、膀胱癌、肝癌等均觀察到LINE-1低甲基化。LINE-1為高度重復(fù)序列，散布的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，人類基因約15％由其構(gòu)成，長度6 kb以上，大約40萬拷貝，可將遺傳信息準(zhǔn)確地插入某些特定位置，以DNA-RNA-DNA方式轉(zhuǎn)座。甚至拷貝數(shù)高于LINE-1的Alu序列也低甲基化，其占人類基因組大于10％，長度約0.3 kb，大于100萬拷貝，它也能移動(dòng)，偶爾引導(dǎo)癌癥相關(guān)基因插入。在乳腺癌，卵巢上皮細(xì)胞癌，Wilms腫瘤中，Chr1著絲粒主要DNA構(gòu)件Satα及在近著絲粒區(qū)，BstBI位點(diǎn)低甲基化，Chr1 Sat2和Chr16 Sat2 低甲基化。肝細(xì)胞癌中，Chr9長的近著絲粒區(qū)主要構(gòu)件Sat2和Sat3均低甲基化〔13〕。

DNMT3b基因突變會(huì)引發(fā)罕見的常染色體隱性遺傳(ICF)綜合征。由于DNMT3B基因失活，阻斷了從頭甲基化，使重著絲粒異染色質(zhì)的主要構(gòu)件典型的Sat2和Sat3 低甲基化，引起一種罕見的精神，面部失常癥狀〔1，8，13〕。

最新的一項(xiàng)研究顯示，由幽門桿菌(PY)感染引發(fā)的胃癌，在不同靶細(xì)胞Alu和Satα低甲基化；LINE-1僅在原發(fā)性胃癌低甲基化，人胃癌不總是基因組低甲基化〔14〕。

近些年研究成果闡明了為何三苯氧胺(tamoxifen)治療乳腺癌的同時(shí)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌這一長期倍受公眾和科學(xué)界關(guān)注的重要問題。Tamoxifen不僅影響雌激素相關(guān)靶基因的表達(dá)，而且調(diào)控一些獨(dú)特的基因，PAX2基因在介導(dǎo)雌激素(E2)和Tamoxifen刺激的子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和癌變過程中起著關(guān)鍵作用。在癌變的細(xì)胞中，PAX2基因啟動(dòng)子低甲基化，E2激活E2受體(ER)與Sp1、共激活子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，促進(jìn)基因表達(dá)。而在正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，PAX2基因高甲基化特異性結(jié)合MeCP2與SIN3A、HDAC共同形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，ER不能被E2激活，抑制轉(zhuǎn)錄。這一發(fā)現(xiàn)為子宮內(nèi)膜癌的治療和預(yù)防提供了新的思路和藥物靶點(diǎn)〔15，16〕。

在腫瘤的起始及進(jìn)展過程中，DNA甲基化和組蛋白去乙?；歉淖儽碛^遺傳創(chuàng)建新治療方法的重要靶點(diǎn)。與基因改變的不可逆性相比，腫瘤表觀遺傳學(xué)改變是可逆的。5-雜氮胞苷酸和5-雜氮2脫氧胞苷酸是研究最廣泛的DNMT抑制劑。作為核苷酸類似物在DNA復(fù)制時(shí)，摻入到自然胞嘧啶堿基位置，這僅發(fā)生在S期。一旦摻入到DNA上，復(fù)合體會(huì)形成DNMT的活性位點(diǎn)，共價(jià)結(jié)合捕獲DNMT，降低酶的活性，在幾次細(xì)胞分裂后，DNA去甲基化，沉默的抑癌基因重新活化。5-雜氮胞苷酸也可以摻入到RNA，干擾蛋白質(zhì)的翻譯，對酶的抑制更加有效。它們也可作為血管生成抑制劑，抑制腫瘤上皮細(xì)胞和血管生成。(Zebularine)是新的DNMT抑制劑，非常穩(wěn)定，適合口服，毒性小，對腫瘤細(xì)胞有高選擇性。Procainamide、Epigallocathechin-3-gallate、MG98等也具有類似作用〔17〕。

2 DNA甲基化檢測方法

2.1亞硫酸氫鈉法 亞硫酸氫鈉法的基本原理是：亞硫酸氫鈉可以通過磺酸基作用使胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，后者經(jīng)PCR擴(kuò)增變成胸腺嘧啶T，形成T：A的配對。但甲基化的胞嘧啶并未改變。甲基化狀態(tài)不同的DNA片段就轉(zhuǎn)化為有堿基序列差異的兩個(gè)片段。這種差異可以用DNA測序，或者聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法，或者是進(jìn)行不同引物的PCR擴(kuò)增等方法來把它們顯示。

2.1.1亞硫酸氫鈉法依賴的基因測序法〔18〕

2.1.2亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法(COBRA) 樣本經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后，某些堿基序列的改變可以產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶圖譜。為調(diào)查類固醇17-α-羥化酶CYP17A2基因-2544～-1522的甲基化狀態(tài)，處理基因組后，PCR產(chǎn)物產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，F(xiàn)okl識別GGATG，EcorⅠ識別GAATTC，Acil識別CCGC，Dral識別TTTAAA。酶切PCR產(chǎn)物，以鑒別。這種方法工作量和耗費(fèi)相對較小，快速，但只能獲得特殊酶切位點(diǎn)甲基化的信息〔19〕。

2.1.3甲基化特異性PCR(MS-PCR) 目的片段經(jīng)處理后，設(shè)計(jì)甲基化和非甲基化兩種引物，樣本DNA根據(jù)自身的甲基化狀態(tài)在相應(yīng)的PCR組中得到擴(kuò)增，甲基化引物含有3個(gè)CG，靠近3＇端，結(jié)果凝膠電泳圖像顯示出來。此方法對測定多種腫瘤抑癌基因(p16，p15，E-cadherin等)具重要性。為增加MS-PCR 的靈敏度，采用巢式PCR，設(shè)計(jì)兩對引物，一對引物對應(yīng)的序列在模板的外側(cè)，為外引物(M2，U2)，另一對互補(bǔ)序列在同一模板的外引物的內(nèi)側(cè)，為內(nèi)引物(M，U)。此法特異性高，工作簡單，耗費(fèi)和耗時(shí)都較小〔20〕。

2.1.4甲基化敏感的單核苷酸擴(kuò)增法(Ms-SNuPE) 可快速判斷DNA片段中某些具體位點(diǎn)的甲基化狀況，定量分析。DNA樣本經(jīng)處理，PCR擴(kuò)增，凝膠電泳分離目的片段。在p16基因5＇端CpG島選擇3個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)引物，使引物的3＇端緊鄰被檢測的堿基上。然后把該引物、Taq酶、PCR產(chǎn)物和32P標(biāo)記的dCTP作為PCR體系混合擴(kuò)增。如果該位點(diǎn)發(fā)生了甲基化，放射性的dCTP將進(jìn)入合成的序列，產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，放射性成像即可顯示。而如果沒有甲基化，該位點(diǎn)經(jīng)處理轉(zhuǎn)變?yōu)門，32P-dCTP無法進(jìn)入，條帶為陰性。再檢測另一組非甲基化，將32P-TTP摻入，又可得到陽性條帶。測定C：T信號比值。通過放射性強(qiáng)度來定量分析，并能檢測不對稱甲基化。但不能對較長序列進(jìn)行全面的考察，多位點(diǎn)檢測需要設(shè)計(jì)較多的引物。用到放射性物質(zhì)也是其缺陷之一〔21〕。

2.2甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶法 一些限制性內(nèi)切酶含有CpG雙核苷酸序列識別位點(diǎn)，它們往往只識別甲基化的序列，而對非甲基化沒有活性，這類酶中比較重要的BstUⅠ、NotⅠ和SmaⅠ。以此設(shè)計(jì)許多方法。

2.2.1甲基化敏感的限制性圖譜(MSRF) 將目的片段或基因組分為兩份，兩者均用MseⅠ(甲基化不敏感的酶，識別TTAA)處理，將大片段切割成適當(dāng)大小片段，并且其中一份加入BstUⅠ(甲基化敏感的酶，識別CGCG)，設(shè)計(jì)引物為10個(gè)核苷酸，其3＇端為CGCG，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后把兩份樣本電泳分離，對照。在MseⅠ組和MseⅠ/ BstUⅠ組中同時(shí)出現(xiàn)的條帶就是甲基化位點(diǎn)出現(xiàn)的部位。若進(jìn)行基因組DNA檢測，還應(yīng)進(jìn)一步作Southern雜交以分離和確認(rèn)〔22〕。

2.2.2限制性標(biāo)志物全基因組掃描(RLGS) 可同時(shí)分析2 000個(gè)以上片段的甲基化情況，基因組DNA以Landmark酶消化，此酶為關(guān)鍵酶，常用甲基敏感的NotⅠ(GC↓GGCCGC)或AscⅠ(GG↓CGCGCC)，切割頻率低且識別序列至少含2個(gè)CpG位點(diǎn)。切割后放射性標(biāo)記末端。再以EcoRⅤ(甲基不敏感，切割頻率較NotⅠ高)消化產(chǎn)生較短的NotⅠ-EcoRⅤ片段，電泳展開。然后，用HinfⅠ(甲基不敏感，切割頻率較EcoRⅤ高)在凝膠內(nèi)消化，產(chǎn)生更短的片段。將凝膠旋轉(zhuǎn)90°第2次電泳，顯影成RLGS圖譜。兩個(gè)樣本比較，樣本中缺失的斑點(diǎn)為甲基化位點(diǎn)。計(jì)算機(jī)可快速識別缺失斑點(diǎn)，對基因組甲基化狀態(tài)進(jìn)行整體分析。集中考察非甲基化區(qū)域，避免了重復(fù)序列的干擾。需要大量的DNA，技術(shù)復(fù)雜〔23，24〕。

2.2.3差異性甲基化雜交分析(DMH) 腫瘤基因組DNA經(jīng)MseⅠ TTAA消化為100～200 bp的小片段，其識別序列很少位于CG豐富區(qū)，保持了CpG島的完整性，以用于構(gòu)建CpG島文庫。正常基因組DNA也同樣處理，富含CG片段的末端連上接頭。消除重復(fù)序列。再以BstUⅠ CGCG消化。將MseⅠ和MseⅠ/BstUⅠ處理后片段分別進(jìn)行PCR，得到MseⅠ和MseⅠ/BstUⅠ處理的擴(kuò)增子。將其作為掃描高甲基化序列的探針。點(diǎn)樣膜上制成高密度的CpG島文庫微陣列。將正常標(biāo)本及乳腺癌ZR-75-1、Hs578t(A，B，C)32P標(biāo)記的MseⅠ處理的擴(kuò)增子在3個(gè)膜上進(jìn)行雜交，以32P標(biāo)記的MseⅠ/BstUⅠ處理的擴(kuò)增子在另外3個(gè)膜上進(jìn)行雜交(A＇，B＇，C＇)。成像可得到甲基化信息。應(yīng)用高密度DNA陣列雜交，大通量，易自動(dòng)化。但會(huì)造成假陽性結(jié)果。可克隆，測序或Southern雜交進(jìn)一步證實(shí)〔25〕。

2.2.4甲基化CpG島擴(kuò)增子分析(MCA) 通過擴(kuò)增2個(gè)相鄰(<1 kb )SmaⅠ位點(diǎn)(CCCGGG)來富集甲基化的CpG島。甲基化敏感的SmaⅠ識別CCCGGG序列，但并不切割甲基化位點(diǎn)，產(chǎn)生平端，隨后以甲基化不敏感的SmaⅠ的同裂酶XmaⅠ消化，產(chǎn)生CCGG黏端，再連上接頭，PCR擴(kuò)增，得到MCA的擴(kuò)增子。在尼龍膜上點(diǎn)樣，以任何感興趣探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，可半定量，腫瘤標(biāo)本可檢測到異常的甲基化擴(kuò)增子。技術(shù)復(fù)雜，易受重復(fù)序列干擾〔26〕。

2.3化學(xué)測序法為基礎(chǔ)的甲基化分析

2.4單核苷酸鑒定法

2.4.1相鄰鄰居法

2.4.2逆相高壓液相層析(RP-HPLC) 5類核苷酸在極性溶液中的溶解度不同，在經(jīng)過非極性的過濾柱時(shí)，溶解度高的dCMP隨極性溶液先流出，而溶解度低的dAMP則在柱中停留時(shí)間長，后流出。它們出柱的順序是dCMP、5mdCMP、dTMP、dGMP、dAMP。通常先用DNaseⅠ水解DNA片段，并裝好非極性的硅膠柱(它使非極性的碳?xì)浠衔锘瘜W(xué)結(jié)合到硅膠表面)。水解產(chǎn)生的單核苷酸溶液注入柱內(nèi)，將流出的液體用紫外線吸光監(jiān)測儀進(jìn)行檢測，記錄結(jié)果輸入電腦繪成吸光度-時(shí)間表。根據(jù)波峰的早晚及高度，測定出5類核苷酸的相對含量?？筛鼫?zhǔn)確分析基因組中甲基化的含量。需專門設(shè)備，DNA的純度要求較高，不能混入RNA〔27〕。

2.5甲基接受力檢測法〔28〕

2.6MBD柱分離甲基化CpG島〔29〕

2.7基因表達(dá)陣列法 腫瘤中，抑癌基因的失活是基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化的結(jié)果。降低甲基化程度可以逆轉(zhuǎn)基因表達(dá)，使其上調(diào)。用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DAC)和HDAC抑制劑(TSA)處理細(xì)胞，將表達(dá)的基因片段用cDNA陣列法檢測出來，與非藥物處理組的結(jié)果相比較，就可獲知某個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化情況〔30〕。

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