?？颂婺嵴T導(dǎo)人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞凋亡及對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

張秀艷 石國(guó)剛 劉秀艷 葛紅娣

(遵化市人民醫(yī)院,河北 遵化 064200)

結(jié)腸癌5年生存率為62％〔1〕?；熓侵委熗砥诮Y(jié)腸癌的主要手段之一〔2〕。研究表明，65％～70％的結(jié)直腸腫瘤組織中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)過(guò)表達(dá)，EGFR信號(hào)途徑和晚期結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系〔3〕。本文觀察埃克替尼誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的凋亡及對(duì)相關(guān)凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8的影響，旨在進(jìn)一步觀察EGFR對(duì)結(jié)腸癌及其相關(guān)影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 Caco-2細(xì)胞株(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)；培養(yǎng)于含有10％胎牛血清、10 g/L非必需氨基酸、10 g/L谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素雙抗液的(DMEM)完全培養(yǎng)基,在37℃、5％ CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng), 3 d可基本融合。將Caco-2細(xì)胞接種于Transwell板上(孔徑0.8 μm), 接種密度為1×104/cm2, 隔天換液；胎牛血清(Gibco, 美國(guó))；Transwell培養(yǎng)板(Cornig,美國(guó)), GAPDH抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κBp65抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2方法 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化，調(diào)節(jié)Caco-2細(xì)胞濃度，以3×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入 MTT 溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h，輕輕吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，選擇490 nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光密度(OD)值，細(xì)胞抑制率=〔(空白對(duì)照組 OD 值-各實(shí)驗(yàn)組 OD 值)/空白對(duì)照組OD值〕× 100％。

1.3結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 收集埃克替尼作用24、48、72 h及空白對(duì)照組的細(xì)胞 ,調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml,取25 μl的細(xì)胞懸液同1 μl的AO/EB染液混勻，吸取10 μl的混合液置于一潔凈的載玻片上 ,蓋玻片封片后 ,置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4Western印跡檢測(cè)NF-κBp65蛋白水平的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清測(cè)定濃度后-80℃保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE電泳分離，完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5％脫脂奶粉封閉，后放入含一抗的TBST溶液，4℃過(guò)夜，洗膜，然后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫反應(yīng)1 h，目標(biāo)蛋白質(zhì)用DAB顯色。計(jì)算機(jī)掃描，以GAPDH蛋白做參照，分析處理。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1埃克替尼對(duì)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制情況 隨著?？颂婺釋?duì)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞作用濃度的增加和時(shí)間延長(zhǎng)，結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制，并呈劑量和時(shí)間依賴性(P<0.05)。24、48、72 h?？颂婺嵋种平Y(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的IC50值分別為(98.7±9.6)μmol/L,(73.5±6.8)μmol/L和(68.2±5.9)μmol/L，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.864 ,P=0.000)。

2.2?？颂婺釋?duì)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞凋亡的影響 10 μmol/L?？颂婺嶙饔?4、48、72 h的結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞凋亡率分別為(8.95±1.11)％，(13.90±1.34)％和(15.4±1.67)％，作用48 h后早期凋亡細(xì)胞開(kāi)始減少，而晚期凋亡和壞死細(xì)胞上升，表明?？颂婺釋?duì)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞作用通過(guò)早期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡繼而導(dǎo)致細(xì)胞壞死。

2.3Western印跡檢測(cè) Icotinib處理組PARP蛋白Caspase-3和Caspase-8出現(xiàn)裂解片段，且隨著Icotinib劑量的增加，裂解片段亦增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

結(jié)腸癌一般均采用外科手術(shù)作為有效的治療手段。大部分結(jié)腸癌由于其癥狀的不典型和隱匿性，導(dǎo)致大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)〔4〕。靶向藥物是針對(duì)靶點(diǎn)的治療，即使是不同病理類型的腫瘤，只要存在相應(yīng)的靶點(diǎn)，均可能有效；EGFR在多數(shù)上皮來(lái)源的腫瘤中均有強(qiáng)弱不同的表達(dá)，在結(jié)直腸腫瘤中均呈過(guò)度表達(dá) , 參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移〔5〕。EGFR 一直是腫瘤治療的熱點(diǎn)，因此發(fā)展了多種抗EGFR治療的藥物，包括單克隆抗體- 西妥昔單抗和小分子酪氨酸激酶抑制劑?？颂婺帷?〕。Icotinib是一種口服的EGFR-TKI，主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合位點(diǎn)抑制EGFR二聚體的磷酸化，關(guān)閉下游信號(hào)通路的活化。

本研究結(jié)果證實(shí)埃克替尼通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的凋亡發(fā)揮其抗腫瘤作用。腫瘤的增生主要取決于細(xì)胞的增生和凋亡引起的細(xì)胞死亡〔6〕。凋亡機(jī)制的減弱或障礙可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，同樣，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤的消除起到一定的積極作用。在細(xì)胞死亡途徑中，首先激活的是啟動(dòng)型Caspase，如Caspase-8 Caspase-9，而后通過(guò)級(jí)聯(lián)放大過(guò)程激活執(zhí)行型Caspase，如Caspase-3 Caspase-7等，最終特異性地裂解其底物即聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，使 細(xì) 胞 發(fā) 生 生化及形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔7〕。?？颂婺崽幚斫M顯著誘導(dǎo)PARP蛋白Caspase-3和Caspase-8的活化裂解。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，?？颂婺嵬ㄟ^(guò)促進(jìn)PARP蛋白Caspase-3和Caspase-8的活化裂解，誘導(dǎo)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Jemal A, Siegel R, Ward E,etal.A study on alkaline heat treated MgCa alloy for the control of the biocorrosion rate〔J〕.Acta Biomater,2009；5(7):2790-9.

2Sileri P，Dugo S，Bennavoli D，etal.Metachronous splenicmetastasis from colonic carcinoma five years after surgery：a case report and literature review〔J〕.South Med J，2009；102(7)：733-5.

3Abdelall HS, Mishriky AM, Mohamed FA,etal.Epidermal growth factor receptor in colorectal carcinoma: correlation with clinical pathological prognostic factors〔J〕.Colorectal Dis, 2008；10(2):170-8.

4Skvortsov S,Sarq B,Lindner H,etal.Cetuximab inhibits thymidylate synthase in colorectal cells expressing epidermal growth factor receptor〔J〕.Proteomics Clin Appl, 2008；2(6):908-14.

5徐 玲，張 晗，曲秀娟,等.?？颂婺崽岣呶赴┘?xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的敏感性〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013;6(21):1174-7.

6Korsmeyer SJ.Bcl-2:a repressor of lymrphocyte death 〔J〕.Human Today, 1992;13(2):285-8.

7Munoz-Pinedo C.Signaling pathways that regulate life and cell death: evolution of apoptosis in the context of self -defense〔J〕.Adv Exp Med Biol，2012;738(1):124-43.