潘家琪，宋丹軍，李鵬旭，劉愛明

(寧波大學醫(yī)學院生理藥理學系，浙江寧波 315211)

對乙酰氨基酚(N-acetyl-para-aminophenol，APAP)(撲熱息痛)是臨床最常用的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，也是臨床引起肝毒性的最常見的藥物［1］。長期或過量使用APAP易導致急性肝功能衰竭。因此，APAP肝損傷受到廣泛關(guān)注。近10年來，人們對APAP肝毒性發(fā)生過程中的細胞內(nèi)分子事件有了更多的認識，炎癥細胞和炎癥因子在APAP肝毒性中也發(fā)揮重要作用。許多單體化合物和天然提取物對APAP肝毒性具有對抗作用。

1 APAP肝損傷的細胞內(nèi)分子事件

1.1 APAP肝毒性的代謝激活和啟動

APAP經(jīng)吸收進入體內(nèi)后，90%APAP與葡萄糖醛酸或硫酸結(jié)合后排泄，其余5% ～10%通過細胞色素 P450(cytochrome P450，CYP)系統(tǒng)，特別是 CYP2E1代謝產(chǎn)生 N-乙?；?對-苯醌亞胺(n-acetyl-para-benzoquinone imine，NAPQI)，該毒性代謝物由谷胱甘肽(glutathione，GSH)解毒［2］。新的研究技術(shù)發(fā)現(xiàn)了其下游的代謝物，包括S(5-乙酰氨基-2-羥苯基)β-巰基丙酮酸、3，3-二聚APAP和苯并噻嗪化合物等［3］。一旦肝細胞內(nèi)GSH被耗竭，NAPQI與蛋白質(zhì)的巰基可發(fā)生反應(yīng)形成APAP蛋白質(zhì)加合物;蛋白質(zhì)加合物的形成是關(guān)鍵性啟動事件，它的進一步傳播和放大才導致肝毒性［4］。

1.2 線粒體氧化應(yīng)激與細胞損傷的擴布

APAP過量與線粒體呼吸抑制、肝ATP耗竭及線粒體氧化應(yīng)激有關(guān)［5］。盡管APAP過量導致活性氧的形成增加，但脂質(zhì)過氧化作用并不被認為是細胞損傷的關(guān)聯(lián)機制［6］。相對而言，壞死肝細胞中硝基酪氨酸蛋白加合物染色呈陽性，提示過氧化亞硝酸鹽的形成［7］。APAP過量使用后，誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)會產(chǎn)生一些NO，這些NO與過氧化物快速反應(yīng)形成過氧化亞硝酸鹽。由于超氧負離子不易透過生物膜，過氧化亞硝酸鹽形成主要發(fā)生在線粒體中。雖然GSH可有效清除過氧化亞硝酸鹽，但APAP暴露后胞漿內(nèi)和線粒體內(nèi)的GSH會大量消耗，肝細胞將不受保護。過氧化亞硝酸鹽與蛋白質(zhì)反應(yīng)，致線粒體中的酪氨酸硝基化［8］?；钚匝鹾瓦^氧化亞硝酸鹽至少部分參與對線粒體DNA的損傷和線粒體膜孔的開放，從而觸發(fā)線粒體膜電位崩潰，誘導細胞壞死;迅速恢復(fù)線粒體GSH水平，過氧化亞硝酸鹽就會被有效清除，并減輕細胞損傷［9］。這些數(shù)據(jù)表明，過氧化亞硝酸鹽確實是APAP肝毒性的關(guān)鍵性介質(zhì)。

1.3 核DNA斷裂與APAP的肝毒性

除了線粒體功能障礙外，DNA斷裂繼發(fā)核溶解是APAP誘導的肝損傷機制中另一早期現(xiàn)象。DNA斷裂由瓊脂糖凝膠電泳實驗首次發(fā)現(xiàn)，隨后用TUNEL等方法證實［10－12］。由于 APAP 并不引起胱天蛋白酶酶系的活化，前述DNA斷裂并不等同于細胞凋亡中的DNA斷裂;它們的著色模式和碎片大小等有根本的差異。雖然核酸內(nèi)切酶抑制劑的細胞保護作用表明毒性過程中DNA斷裂，但多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶〔poly(ADP-ribose)polymerase，PARP〕并沒有參與。PARP過度激活導致細胞內(nèi)NAD+和ATP耗竭，從而啟動細胞壞死。然而，在 APAP肝毒性期間，PARP激活多發(fā)生在APAP給藥后6～12 h之間，此時細胞已經(jīng)處在壞死過程中。動物實驗發(fā)現(xiàn)，與PARP野生型小鼠相比，APAP 肝毒性在 PARP－/－小鼠表現(xiàn)加重［13］，表明PARP在APAP肝毒性中確實發(fā)揮了重要作用。

最近研究表明，氧化應(yīng)激/過氧亞硝酸鹽介導的線粒體功能障礙導致核DNA斷裂［8］。APAP過量早期，Bcl-2家族成員 Bax易位到線粒體;在Bax－/－小鼠中，線粒體氧化應(yīng)激水平變化不大，但細胞色素c從線粒體膜間的釋放被延遲，DNA斷裂和肝損傷也被延遲。后期的毒性損傷和DNA斷裂在野生型小鼠和Bax－/－小鼠之間無區(qū)別。上述結(jié)果表明，Bax易位觸發(fā)線粒體蛋白質(zhì)的提前釋放，這可能會促使核DNA斷裂，但后期過氧化亞硝酸鹽損傷發(fā)生時，Bax的影響就會降低。

1.4 c-Jun N 端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路與APAP肝毒性

APAP 5，10 和 20 mmol·L－1與人原代肝細胞孵育，3 h內(nèi)細胞內(nèi)GSH迅速衰竭，同時導致早期APAP蛋白質(zhì)加合物形成和線粒體功能障礙;24 h后肝細胞開始濃度依賴性地壞死。此外，APAP還時間依賴性地觸發(fā)JNK在細胞質(zhì)中的活化，使磷酸化的JNK易位至線粒體。APAP干預(yù)后，用JNK抑制劑SP600125處理3 h可降低JNK活性，并顯著減少細胞死亡［14］。別嘌醇預(yù)處理小鼠可以有效地防治APAP的肝毒性，提前1和18 h給予別嘌醇，給予APAP后早期(2 h)JNK均被激活;提前18 h給予別嘌醇，給予APAP 6 h后JNK激活減弱;表明后期JNK的活化對毒性更為關(guān)鍵［15］。上述研究表明，APAP過量后JNK信號通路在肝損傷過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，提示JNK信號通路可能為潛在的臨床毒性防治的靶點。

1.5 肝細胞代謝功能的變化

基于高分辨率核磁共振技術(shù)的代謝組學研究表明，APAP 500 mg·kg－1導致小鼠線粒體的三羧酸循環(huán)無法利用丙酮酸鹽，同時肝線粒體中脂肪酸β氧化作用減弱［16］。在另一項基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的代謝組學研究中，APAP 400 mg·kg－1通過CYP2E1介導的代謝活化和氧化應(yīng)激可導致脂肪酸氧化作用的不可逆抑制，表現(xiàn)為長鏈脂肪酸代謝物及其代謝基因表達水平的變化［17］。在APAP誘導肝毒性期間，過氧化物酶體增殖物激活受體α的靶基因誘導編碼線粒體UCP2防止活性氧產(chǎn)生增多，同時提示UCP2的誘導也可能是脂肪酸β-氧化過程中對線粒體保護的重要機制［18］。上述結(jié)果表明，線粒體β氧化功能損傷是高劑量APAP肝毒性發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)。

2 APAP引起肝損傷期間的炎癥反應(yīng)

APAP導致肝細胞腫脹死亡，這包括最初12 h內(nèi)巨噬細胞和淋巴細胞的激活，中性粒細胞(4～24 h)和單核細胞(24～48 h)在肝內(nèi)的募集。在APAP的肝毒性期間，通常認為廣泛的無菌性炎癥是有益的，被激活的炎癥細胞不僅參與去除壞死的細胞碎片，還可以限制促炎介質(zhì)的形成和作用，同時促進組織修復(fù)［19］。

2.1 Kupffer細胞和巨噬細胞對APAP肝毒性的作用

大鼠給予 APAP 1200 mg·kg－1后，Kupffer細胞被激活，單核細胞在24 h內(nèi)募集進入肝;使用外源藥物滅活巨噬細胞能夠減輕肝損傷［20］，該保護作用在小鼠APAP毒性模型中也有報道。氯化釓等滅活Kupffer細胞主要通過降低活性氧實現(xiàn)［21］。然而，這種解釋也存在一些問題，首先，大多數(shù)活躍的Kupffer細胞都位于門靜脈周圍區(qū)域，遠離小葉中心過氧化亞硝酸鹽形成的位置和肝損傷的位置［22］。其次，參與巨噬細胞中過氧化物產(chǎn)生的糖蛋白gp91phox缺陷的小鼠和野生型小鼠中，肝損傷和氧化應(yīng)激水平相似［23－25］。因此，雖然 Kupffer細胞在APAP肝毒性中發(fā)揮了重要作用，但尚不能肯定它就是APAP肝毒性時氧化應(yīng)激和過氧化亞硝酸鹽的來源。

2.2 炎癥介質(zhì)對APAP肝毒性的作用

在Kupffer細胞耗竭的小鼠中APAP誘導的肝損傷加重，這與白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)和IL-6的衰減有關(guān)［23］。APAP肝毒性中，IL-6促進肝細胞再生，而IL-10則限制炎癥因子腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和 IL-1 的形成。這些炎癥因子促進iNOS表達，增加過氧化亞硝酸鹽的形成，加重肝損傷。IL-10－/－小鼠中致炎細胞因子形成增加，iNOS表達增加和細胞損傷加重等結(jié)果支持了上述結(jié)論［26］。本課題組最近研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)APAP誘導肝毒性后，陽性對照組IL-6顯著升高，信號轉(zhuǎn)導蛋白和轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(signal transducerand activator oftranscription 3，STAT3)被激活，其下游靶基因細胞因子信號抑制因 子 3(suppressorofcytokinesignaling 3，SOCS3)等表達增加，表明IL-6-STAT3-SOCS3炎癥信號通路參與了APAP肝毒性的發(fā)生(待發(fā)表)。

APAP過量使用后4～24 h，致炎細胞因子TNF-α和 IL-1產(chǎn)生，拮抗 TNF-α或 IL-1能減弱APAP誘導的肝損傷［25］。據(jù)報道，在TNFⅠ型受體基因敲除(TNFR1－/－)小鼠中也表現(xiàn)類似的保護作用。因此，這些細胞因子的促損傷作用被認為與iNOS的誘導和其他炎癥介質(zhì)的形成有關(guān);但也有報道APAP使用后8 h內(nèi)TNF－/－小鼠和野生小鼠肝損傷程度相似［28］;另一項研究中，APAP 300 mg·kg－1導致TNFR1－/－小鼠較野生型更嚴重的肝毒性，磷酸肌醇3激酶的活化被延緩6～12 h［29］。因此，APAP引起組織損傷時TNF-α通過TNFR1發(fā)射信號在調(diào)節(jié)肝細胞增殖中非常重要。

誘導型熱激蛋白(heat shock protein，HSP)如HSP70能有效地對抗APAP誘導的肝損傷。APAP誘導環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)增加前列腺素形成。COX-2－/－小鼠或用COX-2抑制劑處理的動物對APAP更敏感，且增加的肝損傷與HSP誘導缺損有關(guān)。相反，在APAP使用后，巨噬細胞移動抑制因子缺陷(MIF－/－)小鼠僅有輕微的損傷，這與HSP大幅增加相關(guān)［30］。

干擾素 γ(interferon-γ，IFN-γ)是病理生理過程中另一個炎癥介質(zhì)。APAP導致IFN-γ大量形成，在 IFN-γ－/－小鼠中 APAP 肝損傷減輕，中和IFN-γ能減少細胞因子、趨化因子和NO的形成，減少白細胞浸潤。然而，目前仍不清楚其參與保護作用的機制。由于自然殺傷細胞是IFN-γ的主要來源，在自然殺傷細胞和自然殺傷T細胞缺陷的動物中也觀察到類似的保護作用［31］。但這些研究中炎癥組織損傷的機制仍不清楚。

2.3 APAP肝損傷中的組織再生

肝細胞損傷會觸發(fā)組織再生;在臨床和實驗研究中，再生反應(yīng)初期可以限制整體上的損傷和預(yù)防肝衰竭。TNF-α是毒性肝損傷和APAP肝毒性時誘導肝細胞再生的重要介質(zhì)，TNF-α同時能刺激IL-6的形成［32］。IL-6可促進再生和誘導保護性HSP的表達。該信號機制涉及磷酸肌醇3激酶和Akt的激活，從而使STAT3活化;SOCS3過表達可以加劇APAP肝毒性，STAT1激活增強，STAT3激活下降，同時 IFN-γ 和 TNF-α 升高［33］。在體內(nèi)和體外培養(yǎng)肝細胞中，APAP過量使用后，中性粒細胞激活的活化肽78、IFN-γ誘導蛋白10和IL-8等均促進肝組織再生，且效果顯著［34－35］。雖然這些趨化因子能有效地減少后續(xù)損傷，但具體的分子機制還有待研究。

2.4 中性粒細胞在APAP肝毒性中的作用

中性粒細胞在APAP肝毒性中的作用仍然有爭議。APAP給藥后4～24 h，大量中性粒細胞募集至肝;中和中性粒細胞上β2整合素并不能防止APAP所致的肝損傷。很多研究并不支持中性粒細胞在APAP肝毒性機制中的作用，反而提示中性粒細胞參與去除受損細胞或細胞碎片［36］。也有些研究間接提示，中性粒細胞可能參與了APAP誘導的肝毒性;IFN-γ－/－小鼠和自然殺傷細胞和自然殺傷T細胞耗竭的小鼠中APAP肝毒性減輕，中性粒細胞減少［31，37］。目前的實驗證據(jù)并不支持中性粒細胞在APAP肝毒性病理生理過程中的細胞毒性效應(yīng)。

3 APAP肝毒性的防治策略

3.1 基于對抗 APAP毒性代謝物通路的肝毒性防治

NAPQI是 APAP產(chǎn)生毒性主要中間體。C57BL/6小鼠中，吲哚衍生物 NecroX-7降低APAP誘導的JNK磷酸化和3-硝基酪氨酸的形成;也可直接結(jié)合NAPQI減少APAP引起的肝損傷。與N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)相比，NecroX-7顯示了更強的預(yù)防和療效作用［38］。

GSH前體NAC提前給藥保護APAP肝毒性是通過提高清除 NAPQI進行的。小鼠給予 APAP(300 mg·kg－1)1.5 h之后使用 GSH 和 NAC 干預(yù)，活性氧和過氧化亞硝酸鹽水平明顯減少，且GSH(－82%)的保護作用強于NAC(－46%);而增加NAC的劑量可以達到與GSH相當?shù)谋Ｗo作用，說明NAC的保護作用中除了供應(yīng)GSH的合成需要，多余的NAC參與恢復(fù)ATP能量供應(yīng)［39］。在SD大鼠APAP(800 mg·kg－1)肝毒性模型中，相同摩爾劑量(2.4 mmol·kg－1)的NAC、次?；撬岷团；撬犸@示了同等的保護作用，盡管它們的結(jié)構(gòu)和體外抗氧化活性不盡相同;它們的保護作用均表現(xiàn)為氧化應(yīng)激水平和GSH代謝體系的改變，雖然次?；撬岷团；撬岵粎⑴cGSH的合成，但在維持GSH水平、GSH與氧化型GSH比例上卻與NAC功能相當［40］。

在小鼠模型中，韓國紅參(Korean red ginseng，KRG)能夠降低 APAP的 LD50，降低轉(zhuǎn)氨酶活性，改善肝組織病理變化。作用機制研究發(fā)現(xiàn)，KRG通過抑制CYP2E1和誘導谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A2(glutathione S-transferase alpha 2，GSTA2)改變APAP代謝，破壞GSTA2對GSH的催化作用可逆轉(zhuǎn)KRG的作用。人參皂苷Rg3可激活GSTA2的轉(zhuǎn)錄并增加GSTA2蛋白的表達?；贙RG能有效的防止APAP誘導的肝毒性，而皂苷Rg3是KRG的主要成分，人參皂苷Rg3可能是一種潛在的護肝劑［41］。由上可見，GSH耗竭是APAP肝毒性發(fā)生的始動因素，直接補充GSH或增加GSH的合成代謝是當前防治APAP肝毒性的主要策略。

3.2 基于促進能量代謝的肝毒性防治

每天給小鼠腹腔注射氯貝特500 mg·kg－1，連續(xù)10 d，小鼠肝GSH含量顯著增加，并且APAP引起的蛋白質(zhì)芳基化、GSH耗竭及肝細胞壞死明顯減少。提前24 h單次給予相同劑量氯貝特也具有良好的保護作用，但與上述多劑量給藥的保護作用不同，單劑量給藥沒有通過控制蛋白質(zhì)芳基化和GSH水平產(chǎn)生保護作用［42］。氯貝特對APAP肝毒性的保護與早期增加APAP-GSH加合物在膽汁排泄物中的濃度有關(guān)，說明氯貝特的保護作用也發(fā)生在APAP的代謝環(huán)節(jié)。同樣是 PPARα激動劑，Wy-14643和非諾貝特也被證實對APAP引起的肝毒性具有充分的保護作用，且保護作用通過過氧化物酶體增殖物激活受體α的靶基因UCP2產(chǎn)生，其調(diào)控的下游環(huán)節(jié)包括H2O2、GSH、炎癥反應(yīng)和脂肪酸β氧化等［18］。因此，促進肝細胞線粒體的能量代謝是尋找APAP肝毒性防治的策略之一。

3.3 傳統(tǒng)中藥防治APAP肝毒性作用

我國中醫(yī)傳統(tǒng)將柴胡、五味子、三七和丹參等中藥廣泛用于治療肝病，可能具有防治藥物肝毒性的功能。已有研究表明，柴胡能夠調(diào)控炎癥反應(yīng)，柴胡提取物可以減輕APAP肝毒性的發(fā)生。柴胡皂苷d是柴胡的主要有效成分之一，能夠?qū)顾穆然肌⒍谆鶃喯醢芬鸬母窝?、肝癌和肝纖維化等毒性［43－44］。本課題組對中藥單體柴胡皂苷d的研究發(fā)現(xiàn)，提前5 d給柴胡皂苷d 2 mg·kg－1能夠防治APAP 200 mg·kg－1所導致的肝毒性，且該保護作用通過抑制IL-6-STAT3-SOCS3炎癥反應(yīng)通路產(chǎn)生。五味子是中國最常用的護肝傳統(tǒng)中藥之一，其提取物對APAP引起的肝損傷具有明顯的保護作用，該保護作用與上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體α的靶基因Cpt1和Acot1等、恢復(fù)脂肪酸β氧化至正常水平有關(guān)［45］。因此，從傳統(tǒng)中藥中篩選有效單體化合物，對防治APAP肝毒性具有巨大的潛力。

3.4 植物提取物防治APAP肝毒性作用

齊墩果酸(deanolic acid)是植物來源的三萜系化合物，它可防治小鼠APAP的肝毒性，但在核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)敲除小鼠(Nrf2－/－)中保護作用較弱，認為齊墩果酸促進Nrf2的核積聚，誘導Nrf2依賴的靶基因，從而有助于防治APAP的肝毒性［46］。組織病理學觀察和生物化學檢查提示，蝦子花(Woodfordia fruticosa)的甲醇提取物有效地防治APAP引起的大鼠肝損傷，認為其保肝作用是通過抑制肝總蛋白消耗和恢復(fù)GSH水平發(fā)揮的［47］。金櫻子(Rosa laevigate Michx)果中的總皂苷可通過抗氧化作用，誘導自吞噬，抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡發(fā)揮對小鼠的保肝作用，并可能用于防治APAP肝損傷［48］。

在民間，普果拉靈呆明堿(Pergularia daemia)植物常被用于治療肝病和黃疸。其水提取物和乙醇提取物預(yù)處理可顯著減輕由APAP誘導的肝生化指標和組織病理變化，其作用與水飛薊素相當，且乙醇提取物比水提取物有更好的保肝作用［49］。長葉獐牙菜(Swerchia lobgifolia Boiss)的地上部分總植物提取物和甲基獐牙菜口山酮(Swerchirin植物的主要成分)預(yù)處理可顯著降低Swiss小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶等活性，表現(xiàn)出良好的抗 APAP肝損傷的作用［50］。然而上述提取物APAP肝毒性保護作用機制尚不清楚。

4 展望

APAP過量后，肝細胞損傷開始于APAP活性代謝物的產(chǎn)生和 GSH耗竭(0～30 min)，然后共價結(jié)合胞漿和線粒體的蛋白質(zhì)(30～120 min)，引起線粒體功能障礙、活性氧和過氧化亞硝酸鹽形成，從而導致線粒體膜孔開放和線粒體膜電位崩潰(2～6 h);線粒體功能障礙也導致核DNA斷裂和溶解，這些事件都導致肝細胞腫脹壞死。APAP肝毒性的核心是細胞內(nèi)事件導致肝細胞腫脹壞死，炎癥反應(yīng)可能通過支持細胞內(nèi)活動或促進氧化應(yīng)激加重細胞損傷，但炎癥反應(yīng)對去除細胞碎片和促進細胞再生也至關(guān)重要。

目前肝毒性藥物防治已經(jīng)有進展，所涉及的保護機制包括調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、脂肪酸β氧化和APAP代謝排泄等?；谀壳暗恼J識，導致細胞腫脹壞死的信號轉(zhuǎn)導機制可能存在大量的關(guān)聯(lián)靶點，深入研究代謝活化和共價結(jié)合后的生化事件，加強對傳統(tǒng)中藥的開發(fā)，都將對APAP肝毒性的藥物防治產(chǎn)生積極的推動作用。

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