天然抗菌肽的作用機(jī)理與分子改造研究進(jìn)展

張慶華，徐彥召，王 青，趙志雨，尚田田，胡建和

（河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003）

目前細(xì)菌耐藥問(wèn)題的日益嚴(yán)重，如超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生，以及動(dòng)植物食品的藥物殘留問(wèn)題，給人類的健康安全產(chǎn)生重大的威脅。而在過(guò)去的幾個(gè)世紀(jì)，新型抗菌藥物的研發(fā)進(jìn)展一直進(jìn)展緩慢。因此人們急需一種抗菌活性高、安全、不易產(chǎn)生耐藥性的新型抗菌藥物。在尋找抗生素替代藥物的過(guò)程中，人們逐漸把眼光投向了抗菌肽。

抗菌肽（Antimicrobial Peptides，AMPs）是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中保留下來(lái)的古老而又有效的天然免疫重要活性分子，參與機(jī)體的第一道免疫防線，是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1]?？咕脑谧匀唤缰袕V泛存在細(xì)菌、病毒、植物、動(dòng)物包括人體內(nèi)?？咕膶?duì)革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌、病毒、癌細(xì)胞，包括多重耐藥菌及HIV病毒都有抑制作用[2-3]。且有實(shí)驗(yàn)表明，抗菌肽用于外傷感染時(shí)既可抑制細(xì)菌感染又能促進(jìn)傷口的愈合[4]。由于抗菌肽具有高效抗菌、無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，是目前國(guó)際公認(rèn)的抗生素最佳替代品。

然而，天然抗菌肽也并非是完美的，大部分的天然抗菌肽抑菌活性并不高，且在發(fā)揮抑菌效果的同時(shí)，往往對(duì)正常的真核細(xì)胞也產(chǎn)生毒性，以及溶血作用，這都限制了抗菌肽的發(fā)展應(yīng)用。因此，目前對(duì)抗菌肽的研究重點(diǎn)在于，通過(guò)對(duì)人工設(shè)計(jì)的一系列不同抗菌肽類似物的研究，探明其抑菌、細(xì)胞毒性、溶血活性的機(jī)制，從而為獲得抑菌活性高，對(duì)正常真核細(xì)胞低毒甚至無(wú)毒性、無(wú)溶血性，高效、安全的抗菌肽奠定理論基礎(chǔ)。

到目前為止發(fā)現(xiàn)的抗菌肽已有2 000多種。已測(cè)定了幾百種不同抗菌肽的氨基酸序列，這些抗菌肽在長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)、序列上各有明顯的不同，抗菌肽大多由20～40個(gè)氨基酸殘基組成，且其一級(jí)結(jié)構(gòu)具有明顯的特征，即肽鏈中間富含脯氨酸（Pro），C端富含Gly、Val和Ala等非極性氨基酸，而N端多含精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）等極性的氨基酸[5]。因此他們都表現(xiàn)兩個(gè)共同的特征：陽(yáng)離子肽；活性結(jié)構(gòu)為兩親性。目前對(duì)抗菌肽的作用機(jī)理還沒(méi)有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，但是大多數(shù)的理論都認(rèn)為其作用機(jī)制與其陽(yáng)離子性和疏水性有關(guān)。因此，為了獲得安全、高效的抗菌肽，目前對(duì)抗菌肽的結(jié)構(gòu)功能研究以及分子設(shè)計(jì)主要是圍繞改變其離子性和疏水性進(jìn)行。

1 抗菌肽的結(jié)構(gòu)分類

在Boman發(fā)現(xiàn)抗菌肽后，最初根據(jù)結(jié)構(gòu)，將抗菌肽分為如下5類：

（1）具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的線性抗菌肽。不含Cys，目前此類成員最多，天蠶素（Cecropins）、滑瓜蟾素（Magainins）屬于此類。

α-螺旋是一種具有水脂兩親性的結(jié)構(gòu)，存在于多種蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，許多膜蛋白、信號(hào)肽以及具有膜識(shí)別功能的蛋白質(zhì)中都含有此結(jié)構(gòu)，是抗菌肽裂解細(xì)菌膜的重要活性區(qū)域。

Cecropin是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的天然抗菌肽的研究者，此后人們陸續(xù)從家蠶、果蠅、柞蠶、麻蠅中分離得到cecropin類抗菌肽，這類多肽一般含有37～39個(gè)氨基酸殘基，不含Cys，其C端區(qū)域可形成疏水性的螺旋結(jié)構(gòu)，N端區(qū)域具有較強(qiáng)的堿性，可形成典型的雙親性螺旋結(jié)構(gòu)，兩者之間存在由脯氨酸和甘氨酸形成的鉸鏈區(qū)。且多數(shù)肽的C端被酰胺化，研究表明酰胺化對(duì)其抗菌活性具有重要作用。

Magainins也是最初從蟾蜍的皮膚中分離得到的一種具有雙親螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽，后來(lái)在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)組織和腸道組織中發(fā)現(xiàn)了其類似物。Magainins對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌、真菌、原生動(dòng)物都有殺傷作用，但是對(duì)革蘭陰性菌的活性比cecropins要低10倍左右[6]。

（2）富含某種氨基酸（但不含Cys）的抗菌肽。在其結(jié)構(gòu)中有一種或兩種氨基酸殘基重復(fù)出現(xiàn)，如PR-39、Indolicidin和Histantins。

PR-39最先在1991年由Agerberth等人在豬的小腸中分離純化得到，對(duì)其序列分析顯示，PR-39由39個(gè)氨基酸殘基組成，故將其命名為PR-39（Proline-arginine-rich），其一級(jí)結(jié)構(gòu)中富含精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro）兩種氨基酸殘基，其中Arg10個(gè)、Pro19個(gè)，在其結(jié)構(gòu)中，精氨酸和脯氨酸形成的Pro-Arg-Pro結(jié)構(gòu)可能與細(xì)菌的磷脂膜的相互作用有關(guān)[7]。

（3）含1個(gè)二硫鍵的抗菌肽。該二硫鍵的位置通常在肽鏈C端。目前此類成員最少，最先被發(fā)現(xiàn)的是在牛嗜中性粒細(xì)胞中分離得到的Bactenecin，其由12個(gè)氨基酸組成，其中精氨酸有4個(gè)，并在其第2位和第11位氨基酸殘基間形成二硫鍵，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌都有抑制活性。這類抗菌肽還包括蛙Brevinins-1、-2等，都研究的較清楚。

（4）含2個(gè)或2個(gè)以上二疏鍵的抗菌肽，多為β-片層結(jié)構(gòu)。如防御素（Defensins）如爪蟾皮膚細(xì)胞中產(chǎn)生的Brevinins。有兩個(gè)或兩個(gè)以上二硫鍵，具有β-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽。如綠蠅防御素(Phom lindefensin)，其分子內(nèi)有6個(gè)Cys形成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，肽鏈C末段是帶有擬β-轉(zhuǎn)角的反向平行的β片層。

（5）來(lái)源于具有其他功能的大分子蛋白的抗菌肽，如羊毛硫抗生素（Lactoferricins）是一類由細(xì)菌基因編碼，在核糖體中合成，經(jīng)翻譯加工后而含有一些特殊有機(jī)基團(tuán)的多肽抗生素。如乳鏈菌肽（Nisin），產(chǎn)自乳酸桿菌，含有羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等特殊基因，由34個(gè)氨基酸殘基組成，只對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有作用。

2 抗菌肽作用機(jī)理研究進(jìn)展

雖然目前對(duì)抗菌肽的生物活性作用機(jī)制還沒(méi)有統(tǒng)一的理論體系，但大多數(shù)人認(rèn)為抗菌肽主要通過(guò)作用于細(xì)胞膜而發(fā)揮其生物活性作用[8]。關(guān)于抗菌肽與細(xì)胞膜作用機(jī)制，比較認(rèn)同的有“桶板”模型和“毯式”模型兩種方式。

2.1“桶板”模型“桶板”模型的理論早在1977年由Ehrenstein和Leca等人提出[9]。后在1988年Oren Z等人據(jù)此理論對(duì)抗菌肽對(duì)細(xì)胞膜的作用方式進(jìn)行解釋。由于大多數(shù)的抗菌肽帶有正電荷，細(xì)胞膜帶負(fù)電荷，靜電吸引作用使抗菌肽在細(xì)胞膜表面發(fā)生聚合，單分子的抗菌肽形成多聚體，并以垂直細(xì)胞膜表面的形式將其疏水基團(tuán)嵌入細(xì)胞膜的磷脂雙分子層內(nèi)，形成橫跨細(xì)胞膜的離子通道，其他的多聚體在通道周圍連續(xù)的插入，不斷擴(kuò)大通道的范圍，在細(xì)胞膜表面形成大的孔洞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，細(xì)胞膜內(nèi)外可自由發(fā)生物質(zhì)交換，最終使膜發(fā)生崩解。雖然該理論確認(rèn)了抗菌肽的陽(yáng)離子性和兩親性結(jié)構(gòu)在作用機(jī)制中的重要作用?，F(xiàn)在研究表明，抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)為圓柱形的α-螺旋分子結(jié)構(gòu)，在圓柱形縱軸的一端為帶正電荷親水基，對(duì)稱端為疏水基[10]。但是在“桶板”理論中抗菌肽在嵌入細(xì)胞膜中是以垂直細(xì)胞膜的形式將疏水基插入磷脂層內(nèi)部，而不是帶正電荷的親水一段最先嵌入磷脂層，明顯和抗菌肽與細(xì)胞膜結(jié)合的靜電吸引動(dòng)力學(xué)不相符，因此僅是疏水基在形成垂直孔道前，其在膜表面的“錨定”機(jī)制還有待深入研究。

2.2“毯式”模型 1992年P(guān)ouny Y提出“毯式”模型理論[11]。與“桶板”模型相比，在該學(xué)說(shuō)中，抗菌肽同樣通過(guò)電荷吸引作用結(jié)合于細(xì)胞膜表面。但是，并不進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)部，大量抗菌肽被吸引結(jié)合至細(xì)胞膜表面后，像地毯一樣平行排列于細(xì)胞膜表面，當(dāng)抗菌肽的濃度達(dá)到一個(gè)臨界濃度時(shí)，在分子張力和疏水作用下，細(xì)胞膜的表面張力發(fā)生改變，抗菌肽所覆蓋范圍的細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，形成不穩(wěn)定的磷脂膜，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)明顯的皺褶彎曲甚至破裂，可使細(xì)胞膜內(nèi)外發(fā)生物質(zhì)相互滲透，改變細(xì)胞膜內(nèi)外的正常滲透壓，抗菌肽分子也可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。目前已有學(xué)者通過(guò)對(duì)抗菌肽進(jìn)行固態(tài)核磁共振實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果支持該學(xué)說(shuō)。王興順等采用偏光衰減全反射傅立葉變換紅外光譜技術(shù)（ATR-FTIR技術(shù)）對(duì)在蛾血淋巴中提取的Cecropin P1進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Cecropin P1與細(xì)胞膜結(jié)合后緊貼在細(xì)胞膜表面而不進(jìn)入疏水環(huán)境，Cecropin P1覆蓋區(qū)域的細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，并破壞膜的完整性[13]。

2.3 抗菌肽作用機(jī)制研究進(jìn)展 He、Lazaridis T等人采用基于粗粒化模型的模擬方法建立了53種具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的天然抗菌肽的隱式膜模型[13]。通過(guò)對(duì)收集到關(guān)于抗菌肽分子在磷脂雙分子層聚集的模擬過(guò)程中結(jié)合能與自由能等熱動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，以及表面電荷變化的數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)，決定抗菌肽的生物活性的兩個(gè)重要因素：抗菌肽與膜的親和力以及所結(jié)合生物膜所能承受的臨界表面覆蓋率（可能在50%～90%）。相比于計(jì)算機(jī)全原子模擬，隱式膜的模擬方法可在更長(zhǎng)時(shí)間尺度和更大空間尺度上提供模擬體系的自由能、溫度、壓力等關(guān)于蛋白質(zhì)分子在脂質(zhì)雙分子層上聚集過(guò)程的分子動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)數(shù)據(jù)[14]。真核細(xì)胞膜和細(xì)菌膜表面所帶電荷含量的不同影響了抗菌肽對(duì)他們選擇的特異性，因?yàn)槟M抗菌肽的抑菌過(guò)程中，能量轉(zhuǎn)移多發(fā)生在陰離子脂質(zhì)含量超過(guò)30%的膜與抗菌肽之間。而在模擬溶血過(guò)程中，能量轉(zhuǎn)移多發(fā)生在陰離子脂質(zhì)含量在10%左右的生物膜與抗菌肽之間。而且抗菌肽自身的表面結(jié)合率是指示其抑菌活性的一個(gè)重要指標(biāo)，疏水基嵌入生物膜的深度是影響溶血活性的重要因素，而其抗菌活性和溶血活性都受其自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。

Lopez-Oyama等通過(guò)對(duì)二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）脂雙層及十四酰磷脂酸（DMPG）與陽(yáng)離子抗菌肽Bactenecin間的相互作用探索“毯式”模型的形成機(jī)制，在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)肽吸附在DPPC上的過(guò)程，顯示DMPG聚集組裝肽，形成類似于地毯形狀的長(zhǎng)絲狀網(wǎng)格[15]。

Anne等在對(duì)枯草芽孢桿菌中一種陽(yáng)離子多肽（Tat A）進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于自身帶正電荷的特性，Tat A通過(guò)電荷的吸引作用和相鄰的蛋白質(zhì)在連接點(diǎn)進(jìn)行折疊，形成類似于拉鏈“咬合牙齒”的結(jié)構(gòu)，在抗菌肽作用于細(xì)菌生物膜的過(guò)程中，這種電荷”拉鏈原則”，可以將電荷拉鏈浸入疏水的磷脂雙分子膜從而產(chǎn)生一種壓力效應(yīng)，抑制細(xì)菌生物膜的產(chǎn)生[16]。

Mei Hong等通過(guò)核磁共振分析豬源抗菌肽Protegrin-1（PG-1）的在細(xì)胞脂質(zhì)雙層中的研究發(fā)現(xiàn)，PG-1通過(guò)自耦連作用以多聚體的形式插入脂質(zhì)層內(nèi)部，形成跨膜通道，且革蘭陰性菌細(xì)胞膜上脂多糖（LPS）的強(qiáng)負(fù)電荷特性，在抗菌肽對(duì)細(xì)胞生物膜的選擇過(guò)程中起重要作用[17-18]。

3 抗菌肽分子設(shè)計(jì)的研究策略

在目前，對(duì)抗菌肽的抗菌機(jī)理，細(xì)胞毒性、溶血活性等機(jī)制雖尚無(wú)統(tǒng)一理論，但是大多數(shù)理論都認(rèn)為其生物活性與其自身的陽(yáng)離子性和兩親性有密切的關(guān)系?？咕牡年?yáng)離子性決定了其選擇性，能讓其與帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞膜發(fā)生靜電吸引而相互作用，疏水性的氨基酸殘基則保證了抗菌肽能有效的滲透或嵌入細(xì)菌細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層內(nèi)部，形成疏水通道，破壞膜的完整性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜裂解。因此，目前對(duì)抗菌肽進(jìn)行分子改造，進(jìn)行分子設(shè)計(jì)策略可概括為以下兩方面：

（1）以天然抗菌肽構(gòu)效關(guān)系為依據(jù)，通過(guò)C末端酰胺化、對(duì)其一個(gè)或者多個(gè)位置上的氨基酸殘基定點(diǎn)突變、改變肽鏈長(zhǎng)度以及將結(jié)合不同的肽鏈優(yōu)點(diǎn)形成雜合肽等方式，設(shè)計(jì)一系列的抗菌肽類似物，篩選出具有更高活性、安全的抗菌肽。

（2）對(duì)比已測(cè)定具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的天然抗菌肽氨基酸序列，通過(guò)序列修飾改變其α-螺旋結(jié)構(gòu)域及其帶的正電荷量、肽鏈長(zhǎng)度，增強(qiáng)肽鏈的兩親性質(zhì)，設(shè)計(jì)新的序列模型，進(jìn)而篩選出抗菌譜更廣、抑菌活性更高的抗菌肽。

Concetta Avitabile等人從歐洲林蛙中分離得到Temporin-B（TB），分析發(fā)現(xiàn)TB由13個(gè)氨基酸組成，一級(jí)結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)LPIVGNLLKSLL，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TB對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有一定的抑制效果，由于脂多糖分子（LPS）間的自締合作用，TB不易穿透細(xì)菌膜壁，而對(duì)陰性菌抑制效果較差。通過(guò)對(duì)TB進(jìn)行丙氨酸掃描定點(diǎn)突變處理，用丙氨酸代替其一級(jí)結(jié)構(gòu)序列中的一到兩個(gè)氨基酸殘基，得到16種TB類似物，通過(guò)抑菌試驗(yàn)、細(xì)胞毒性及溶血性試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)TB-G6A（即用疏水性更強(qiáng)的丙氨酸-A替換TB一級(jí)結(jié)構(gòu)中第6位的甘氨酸-G得到的類似物）抑制革蘭陽(yáng)性菌的能力明顯增強(qiáng)，而TBP3A、TB-N7A、TB-S11A表現(xiàn)出與TBMIC接近的抑菌水平，其他的TB類似物則都完全失去了抑菌能力。在TB-G6A N端起始部位連續(xù)添加兩個(gè)賴氨酸（K)，延長(zhǎng)了肽鏈長(zhǎng)度，并增加了肽鏈的正電荷量至+4，得到一級(jí)結(jié)構(gòu)為KKLLPIVANLLKSLL的類似物TB-KKG6A，與TB-G6A相比TB-KKG6A對(duì)革蘭陽(yáng)性菌及陰性菌的抑菌活性有明顯的提升，對(duì)革蘭陰性菌的抑制效果也有一定程度的增強(qiáng)，且不表現(xiàn)溶血活性[19]。

Yanga等通過(guò)對(duì)富含精氨酸和脯氨酸的抗菌肽Tritrpticin進(jìn)行研究，用賴氨酸替換Tritrpticin氨基酸序列中的精氨酸，雖然二者的空間結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生明顯的改變，但改變后的抗菌肽抑菌活性增加了2倍且溶血性大大降低。天然的Tritrpticin具有極強(qiáng)的結(jié)合兩性離子和陰離子的能力，而替換后的Tritrpticin僅與陰離子有極強(qiáng)的結(jié)合能力，而與兩性離子的結(jié)合能力降低[20]。

蝎子的抗菌肽IsCT，該抗菌肽沒(méi)有細(xì)胞選擇性，對(duì)哺乳動(dòng)物和細(xì)菌細(xì)胞都有溶解活性。為了探索IsCT的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，Lee等設(shè)計(jì)一種新型具有細(xì)菌特異選擇性的抗菌肽，并合成了幾個(gè)IsCT的類似物，2D-NMR核磁共振分光術(shù)分析溶液中類似物的三維結(jié)構(gòu)。類似物[K7]-IsCT，從第2位的Leu到第13位的Phe是一個(gè)線性α-螺旋；類似物[K7，P8，K11]-IsCT中間有一個(gè)彎折，且其標(biāo)下暗處最強(qiáng)的抗菌活性而無(wú)溶血活性，說(shuō)明脯氨酸引起的彎折對(duì)IsCT的選擇性有重要作用。色氨酸熒光顯示[K7，P8，K11]-IsCT的細(xì)菌高選擇性和其對(duì)富含陰離子磷脂類的高度選擇性有密切關(guān)系[21]。

4 前景展望

2011年，印度新德里NDM-1超級(jí)細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，引起了人們對(duì)抗生素使用的擔(dān)憂，調(diào)查發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題。而抗菌肽由于抗菌機(jī)制獨(dú)特，不易引發(fā)細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，成為發(fā)展新型抗菌劑的研究熱點(diǎn)。但是，目前對(duì)于對(duì)抗菌肽的生物活性機(jī)制的認(rèn)識(shí)還處于模糊和分散的狀態(tài)。因此對(duì)抗菌肽的研究重點(diǎn)在于通過(guò)對(duì)其抑菌作用進(jìn)行綜合、廣泛的研究，通過(guò)明確的生物活性機(jī)制理論，推動(dòng)抗菌肽產(chǎn)品的開發(fā)與臨床應(yīng)用。

自第一個(gè)抗菌肽Cecropin發(fā)現(xiàn)30多年以來(lái)，由于其生物活性機(jī)制獨(dú)特，又在自然界廣泛分布，一直是人們研究的熱點(diǎn)。在“肽時(shí)代”真正到來(lái)之前，我們需要解決的問(wèn)題還有以下幾個(gè)方面：（1）來(lái)源問(wèn)題：天然抗菌肽資源有限，分離提取工藝復(fù)雜，通過(guò)化學(xué)方法合成的成本高昂；（2）抗原性問(wèn)題：與化學(xué)藥物分子相比，抗菌肽的分子量要大得多，故其抗原性也可能比較強(qiáng)，抗菌肽是否會(huì)成為一種強(qiáng)致敏原還尚未可知；（3）因?yàn)榭咕膶儆谝环N活性蛋白質(zhì)，做為口服用藥，如何避免消化道酶的消化作用還有待研究。

目前，對(duì)已發(fā)現(xiàn)抗菌肽的結(jié)構(gòu)特征及生物學(xué)活性研究已經(jīng)比較徹底，但其作用的機(jī)制及其與結(jié)構(gòu)之間存在的具體關(guān)系，目前還不是很清楚。本文通過(guò)對(duì)影響抗菌肽活性的重要因素，如氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)、肽鏈的長(zhǎng)度、α-螺旋結(jié)構(gòu)、特殊氨基酸、正電荷量、疏水性、親水性等方面進(jìn)行了闡述，并對(duì)目前人們較為認(rèn)可的兩種抗菌肽作用機(jī)制：“毯式”模型及“桶板”模型的最新研究進(jìn)展總結(jié)，力求為人工合成抗菌肽的分子設(shè)計(jì)奠定理論基礎(chǔ)。

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