外泌體在心血管疾病中的研究進(jìn)展*

肖 靜， 余細(xì)勇

(1廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究中心, 廣東 廣州 510080； 2南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣東 廣州 510515)

人體諸多生理功能的發(fā)揮是通過細(xì)胞間的信息交換來完成的。目前細(xì)胞之間的信息交換涉及的機(jī)制較為復(fù)雜，其中比較重要的有分泌生長因子、各種小分子物質(zhì)(多肽類、生物活性脂類和核苷酸)、細(xì)胞間接觸和分泌到胞外的基質(zhì)成分等。新近發(fā)現(xiàn)的外泌體 (exosomes)作為一種細(xì)胞分泌到胞外的囊泡狀小體，自發(fā)現(xiàn)以來就不斷引起研究者的興趣。近年來對于exosomes參與心血管疾病生理及病理過程的機(jī)制探索以及將基于exosomes的研究轉(zhuǎn)化于臨床心臟疾病的診治已成為研究前沿和熱點(diǎn)。

1 Exosomes的基本情況

Exosomes是由多種細(xì)胞分泌的雙層模型結(jié)構(gòu)的囊性小泡，直徑為30～100 nm，是已發(fā)現(xiàn)的眾多胞外微粒體的一種。Exosomes由Johnstone等[1]在1987年首次從網(wǎng)織紅細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中分離出來，之后的研究不斷發(fā)現(xiàn)其它多種類型細(xì)胞也可以分泌exosomes, 如: T 細(xì)胞[2]、B 細(xì)胞[3]、樹突狀細(xì)胞[4]以及其它非血源性細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞[5]、施旺細(xì)胞[6]，甚至在其它體液中也可見，如尿液[7]。Exosomes的產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及到多種因子的調(diào)控作用。目前大多數(shù)研究者比較認(rèn)同的機(jī)制是：細(xì)胞在內(nèi)吞時(shí)形成的多泡體(multivesicular bodies, MVBs)，在胞外分泌的過程中，MVBs包含的腔內(nèi)囊泡(intralumenal vesicles, ILVs)可以從MVBs的內(nèi)腔釋放到胞外環(huán)境中，而釋放的這些30～100 nm的ILVs就是exosomes[8]。

細(xì)胞分泌的exosomes內(nèi)包含許多遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)，exosomes到達(dá)胞外后可作用到靶細(xì)胞，從而在細(xì)胞間信息傳遞以及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。Exosomes內(nèi)的DNA或RNA可以通過exosomes傳遞到鄰近細(xì)胞，引起周圍細(xì)胞基因表達(dá)的改變[9]；來源于exosomes的微小RNA(microRNA，miR)在干細(xì)胞分化的調(diào)控(let-7)、胚胎發(fā)育和器官發(fā)生(miR-1)、造血(miR-181)和腫瘤發(fā)生(miR-17、-18、-19、-19b等)等生理和病理生理過程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[10]；exosomes內(nèi)的脂質(zhì)對于維持其正常的結(jié)構(gòu)和功能也有重要作用；另外，exosome還含有4次跨膜蛋白超家族(CD9、CD63、CD81、CD82)可以作為識別不同來源exosomes的蛋白分子標(biāo)記，以及具有功能的熱休克(heat shock protein,HSP)蛋白超家族(HSP70、HSP90)等。

2 Exosomes的生理學(xué)功能

自從Raposo等[11]在1996年發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞也可釋放exosomes后，免疫學(xué)家就推測exosomes可能具有潛在的免疫調(diào)節(jié)功能，且在后續(xù)研究中逐漸得到證實(shí)。有研究者發(fā)現(xiàn)從抗原免疫小鼠的血漿中分離出的exosomes可以抑制Th1型超敏反應(yīng)和Th2型過敏反應(yīng)的應(yīng)答[12]。Wan等[13]發(fā)現(xiàn)激活小鼠的樹突狀細(xì)胞可以通過釋放exosomes而直接增加B細(xì)胞的效應(yīng)作用。成熟突狀細(xì)胞來源的exosomes膜上有縮氨酸耐受的MHCⅠ和MHCⅡ類分子，可以直接和T細(xì)胞受體結(jié)合，激活CD4+或CD8+T細(xì)胞進(jìn)而引起一系列的免疫應(yīng)答[14]。

多種細(xì)胞來源的exosomes內(nèi)均包含mRNA和miRNA，并且諸多研究已證實(shí)它們在exosomes參與細(xì)胞之間信息傳遞的作用機(jī)制中確實(shí)起到重要作用。根據(jù)一個(gè)專門收錄與exosomes研究相關(guān)的數(shù)據(jù)庫ExoCarta(http://www.exocarta.org/)中的信息[15]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的exosomes相關(guān)miRNA的種類為764種，包括let-7、miR-1、miR-15、miR-16和miR-181及各種亞型。這些來源于exosomes的miRNA在生物體許多系統(tǒng)均有一定作用。神經(jīng)元來源的exosomes內(nèi)包含豐富的miRNA，這些exosomes可以直接內(nèi)化進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞中并增加miR-124a和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glutamate transporter 1,GLT1)蛋白的水平；在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞直接轉(zhuǎn)染miR-124a也可以顯著增加GLT1蛋白(但不是mRNA)表達(dá)的水平[16]。

3 Exosomes與心血管疾病

在發(fā)現(xiàn)exosomes早期，研究者較多地聚焦于exosomes在腫瘤中發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的重要作用。許多研究結(jié)果證實(shí)了exosomes是參與癌細(xì)胞和正常細(xì)胞信息交流的重要物質(zhì)，多種細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子超家族等)通過exosomes的攜帶作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞微環(huán)境從而發(fā)揮血管生成及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等過程。近年，隨著對exosomes研究的深入，已證實(shí)exosomes調(diào)控的細(xì)胞間信息交流過程也廣泛參與了心血管系統(tǒng)的生理及病理過程，并在心血管疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制中扮演重要角色。

心臟球(cardiospheres，CSs)是體外培養(yǎng)心臟組織所獲得的自我聚集為球形的細(xì)胞集落。研究發(fā)現(xiàn)心臟球和心臟球來源的細(xì)胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)均可以分泌exosomes，且這些exosomes和其它微粒體一起在成年心臟組織與異體細(xì)胞間的交流中發(fā)揮重要作用[17]，尤其在telocytes(一種在干細(xì)胞微環(huán)境中已發(fā)現(xiàn)具有信息傳遞功能的間質(zhì)細(xì)胞)及其它常駐性心肌祖細(xì)胞(resident progenitor cell)之間[18-19]。Vrijsen等[20]研究證實(shí)來源于心肌祖細(xì)胞的exosomes在體外抓傷實(shí)驗(yàn)中能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，提升的內(nèi)源性心肌的再生能力。心肌成纖維細(xì)胞分泌的exosome能夠在心肌細(xì)胞周圍引起特定的效應(yīng)。當(dāng)用心肌成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞時(shí)，會改變神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)從而改變心肌細(xì)胞內(nèi)Na+離子通道和內(nèi)向整流K+通道的表達(dá)水平[21]。隨后，研究者還發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞exosome能夠向其它某些細(xì)胞傳遞DNA和RNA：Waldenstrom等[9]分別用碘化丙啶和吖啶橙示蹤DNA和RNA，在體外將遺傳物質(zhì)標(biāo)記后的exosome導(dǎo)入成纖維細(xì)胞中，孵育3 h后，激光共聚焦顯微鏡結(jié)果提示來源于外生exosome的DNA和RNA已經(jīng)被成纖維細(xì)胞內(nèi)化。

除了心肌細(xì)胞能夠分泌exosomes之外，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的exosomes在心血管形成機(jī)制中有重要作用。van Balkom等[22]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞來源的exosomes包含的miR-214 在鄰近靶細(xì)胞內(nèi)通過沉默毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變從而刺激血管生成。主動脈內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的包含HSP-70的exosomes可以選擇性地激活單核細(xì)胞，但是在其它類型的內(nèi)皮細(xì)胞中未見類似報(bào)道[23]。內(nèi)皮細(xì)胞exosome來源的HSP70可以募集單核細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)，提示exosome在細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起主要作用，對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧和高糖狀態(tài)下產(chǎn)生的exosomes進(jìn)行指紋分析，發(fā)現(xiàn)其包含1 354種蛋白質(zhì)和1 992種信使RNA，參與了常駐性心肌細(xì)胞的胞內(nèi)壓力應(yīng)激反應(yīng)[24]。此外，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的包含miRNA的微泡參與了內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)2種細(xì)胞之間的信息交流過程，有助于體內(nèi)對抗動脈粥樣硬化、保護(hù)血管內(nèi)皮的作用[25]。

此外，大量研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)心肌細(xì)胞處在某些病理狀態(tài)(如心肌缺血性損傷等)時(shí)，exosomes也參與其中，它或?qū)е缕渌徑?xì)胞病理改變，或提供某些保護(hù)性因子。例如Kuwabara等[26]研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死和心絞痛病人血漿exosomes中miR-1和miR-133a的表達(dá)水平較正常人顯著升高。因而心肌細(xì)胞的exosomes或可以作為信息傳遞的載體，心肌內(nèi)某致病基因一旦出現(xiàn)表達(dá)的改變，將可通過exosomes將這一變化轉(zhuǎn)遞到周圍的細(xì)胞。Exosomes內(nèi)所包含的組蛋白是其來源細(xì)胞分泌的所有組蛋白中的一部分，有研究提示心肌成纖維細(xì)胞分泌的組蛋白可以在體外緩解再灌注心臟的缺血性損傷[27]；但進(jìn)一步卻發(fā)現(xiàn)，條件培養(yǎng)基的心臟保護(hù)性效應(yīng)只有在培養(yǎng)基內(nèi)存在分子量大于50 kD的碎片時(shí)才出現(xiàn)。對這一現(xiàn)象可能的解釋是成纖維細(xì)胞分泌的exosomes足夠容納分子量在50 kD以上的片段，像血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素1[27]這類的低分子量心肌保護(hù)性因子，可以在50 kD大小的碎片中單獨(dú)表達(dá)，也可以包裝在exosomes之中到達(dá)靶細(xì)胞后發(fā)揮效應(yīng)。另外，心肌細(xì)胞在乙醇、高糖等非正常條件刺激下可以增加exosomes的分泌量[28]，這一現(xiàn)象提示當(dāng)心肌細(xì)胞處于某些病理?xiàng)l件下時(shí)，心肌損害的出現(xiàn)可能同其本身所釋放出的exosome有關(guān)。

4 Exosomes對心肌疾病的治療潛能

目前對于心血管系統(tǒng)來源的exosomes功能的研究還處于初始階段，但是exosomes作為缺血性心肌疾病的治療潛能已得到初步證實(shí)。

最近，有研究者采用微泡作為藥物傳遞系統(tǒng)，利用exosomes特異定位細(xì)胞的能力治療某些疾病[29]，該藥物傳遞系統(tǒng)甚至可以傳遞遺傳物質(zhì)到靶細(xì)胞[10]。這個(gè)方法與exosomes模擬物不同，后者采用人工合成的exosomes，其內(nèi)容物只包含基本的定位成分，并且將其它內(nèi)源性成分(endogenous cargo)減到最少[30]。這個(gè)藥物傳遞系統(tǒng)同目前利用脂質(zhì)體進(jìn)行藥物傳遞的方法非常相似[31]，但是，相比一般的脂質(zhì)體藥物傳遞系統(tǒng)，exosomes具有靶向特定的細(xì)胞甚至細(xì)胞亞群的優(yōu)勢。例如，含有外生siRNA的exosomes可以通過血腦屏障傳遞其內(nèi)容物到達(dá)特定的神經(jīng)靶細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，使這些細(xì)胞內(nèi)特定的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)[32]。使用exosomes還可以提高藥效，當(dāng)exosomes內(nèi)被裝上外源性curcumin(一種消炎藥)，可以觀察到該藥的生物利用度、溶解度及穩(wěn)定性都明顯提高[33]，在由脂多糖誘導(dǎo)的感染性休克的小鼠模型中，exosomes傳遞的curcumin可以減少炎癥細(xì)胞因子IL-6和腫瘤壞死因子α的濃度，從根本上提高細(xì)胞在感染性休克狀態(tài)下的生存率。類似的策略可以利用exosomes表面的蛋白靶向心肌細(xì)胞，以期能夠提高藥物作用的專一性，減少治療副作用。Exosomes作為藥物的傳遞系統(tǒng)克服了藥物生物利用率低的缺點(diǎn)，為靶向性特異治療提供了全新的方法。

近年來，除了作為藥物傳遞體的應(yīng)用價(jià)值外，exosomes作為信息載體應(yīng)用于疾病的治療以及在再生醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用前景也得到初步體現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞分泌的exosomes具有心肌保護(hù)作用[34]，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分泌的exosomes可以保護(hù)心肌組織免受缺血與再灌注的損傷[35]、縮小心肌梗死中梗死心肌的范圍[36]以及急性腎小管損傷的范圍[37]。在豬缺血再灌注模型中，來源于間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞分泌的exosomes也有類似研究發(fā)現(xiàn)，這種細(xì)胞產(chǎn)生的exosome可以縮小心肌梗死范圍，提高心功能[38]。Manole等[39]在心梗周圍區(qū)域發(fā)現(xiàn)有來源于telocytes的exosomes出現(xiàn)，提示其可能有潛在的血管生成功能。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)Sca-1+干細(xì)胞通過熱休克(42 ℃處理3 h)處理后，其存活率可顯著提高；我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)熱休克干細(xì)胞通過exosomes分泌熱休克因子1(heat shock factor 1)到胞外并作用于處于缺血狀態(tài)的心肌細(xì)胞，使心肌細(xì)胞凋亡減少，從而顯著改善心功能，這一研究對研發(fā)心肌保護(hù)藥物及解決干細(xì)胞移植治療心肌梗死的瓶頸問題具有重要臨床意義[40]。另外，在心臟受到損傷時(shí)，除了干細(xì)胞分泌保護(hù)性作用的exosomes外，Chen等[41]研究者證實(shí)心肌祖細(xì)胞分泌的exosomes也可以保護(hù)缺血的心肌細(xì)胞不受急性缺血再灌注的傷害，因此心肌祖細(xì)胞來源的exosomes治療心臟疾病或同樣具有廣泛的前景。

5 展望

對于缺血性心肌病，干細(xì)胞療法具有廣泛的應(yīng)用前景，但是宿主細(xì)胞對外來干細(xì)胞的排斥以及干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后細(xì)胞的完整性被破壞是運(yùn)用干細(xì)胞療法主要的困難與挑戰(zhàn)。目前研究熱點(diǎn)正立足于運(yùn)用exosomes解決干細(xì)胞在治療缺血性心臟病中面臨的干細(xì)胞存活率問題，以有利于心肌保護(hù)性藥物治療靶點(diǎn)的探索和完善。因此，心血管系統(tǒng)exosomes的研究對于了解心臟細(xì)胞之間的通訊機(jī)制、疾病的發(fā)生發(fā)展過程、探尋心血管疾病潛在的分子標(biāo)記物以及優(yōu)化心臟疾病的診治均具有重要的臨床意義。此外，通過心臟exosomes的研究技術(shù)與思路，對我們攻克其它難治性疾病(如惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病等)也具有借鑒和指導(dǎo)意義。

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