血吸蟲核受體的研究進展

邱春輝, 劉升發(fā),洪 煬，張 旻，林矯矯

血吸蟲病是由血吸蟲引起的一種重要的寄生蟲病，目前世界上大概有2億人口受到該病原的威脅[1]。血吸蟲主要寄生在宿主靜脈內，為維持正常的生長發(fā)育以宿主的血液為食，并對宿主體內的分子信號做出反應[2]。部分荷爾蒙信號作為正常生理條件下血液的重要成分，在后生動物中通過核受體這一類重要的轉錄調控因子，在一系列重要的生化過程中發(fā)揮重要的作用，包括細胞分化和增殖[3-4]。雖然不同的核受體可以精確地調控各自相關基因表達，但它們含有共同的蛋白結構，包含一個N端-A/B區(qū), 一個 高度保守的 DBD, 一個鉸鏈區(qū)(D區(qū))和一個C-端 LBD區(qū)。到目前為止，寄生于人體的6種重要血吸蟲中：曼氏血吸蟲已有21個核受體被鑒定，其中有14個核受體的全長cDNA已被克隆和研究；日本血吸蟲也有3個核受體的全長cDNA已被克??；而埃及血吸蟲、湄公血吸蟲、馬來血吸蟲、間插血吸蟲還未見有關他們核受體成員的全長cDNA序列的文獻報道[5-6]。

1 曼氏血吸蟲核受體家族(NR)成員

曼氏血吸蟲是一種寄生于哺乳動物終末宿主和螺類中間宿主，呈現(xiàn)雌雄分化、生活史復雜的吸蟲。曼氏血吸蟲是血吸蟲病的一個重要的致病病原，血吸蟲基因組測序已經(jīng)證實，曼氏血吸蟲核受體整個家族含有21個成員[7]。21個核受體的全長或者部分基因序列已經(jīng)被分離出來。進化樹分析顯示，除了三個2DBD-NRs成員，曼氏血吸蟲的核受體大部分都可以在后口動物和節(jié)肢動物中找到同源物。曼氏血吸蟲核受體家族含家族1(NR1)成員6個，家族2(NR2)成員9個，家族4(NR4)成員1個，家族5(NR5)成員2個，二DBD家族(2DBD-NRS)成員3個，在家族3(NR3)和家族6(NR6)中未發(fā)現(xiàn)血吸蟲核受體家族成員。在這21個曼氏血吸蟲核受體成員中，已經(jīng)有14個核受體的全長cDNA被分離和研究[5]。

1.1NR1A成員SmTRa和SmTRβ 兩個與脊椎動物甲狀腺激素受體同源的曼氏血吸蟲SmTRa和SmTRβ，是原肢類動物中最先被鑒定出來的該類核受體[8]。GST-Pull down試驗顯示SmTRa和SmTRβ都可以與SmRXR1形成異源二聚體。這提示著非脊索動物的甲狀腺激素受體可以與脊索動物的RXR樣的甲狀腺激素受體形成異源二聚體。凝膠遷移試驗(EMSA)顯示SmTRa可以以單體或二聚體的形式與以保守的DNA半位點AGGTCA寡核苷酸探針(DR0-DR5Pal0)結合,而SmTRβ與相應的DNA結合能力就比較弱[8]。雖然兩個SmTR都可以與SmRXR1形成異源二聚體，但SmTRa/ SmRXR1和SmTRβ/ SmRXR1未能與檢測的DNA作用元件結合。為了說明SmTRa是否能夠與T3和T4配體結合，作者把曼氏SmTRs的LBD序列與其他物種的甲狀腺激素受體序列進行了比對，發(fā)現(xiàn)保守性不是特別強，提示，SmTRs與T3和T4配體可能不能結合。但是SmTRs在基序一和基序二上都顯示較強的保守性，有必要做相應的實驗來回答該受體是否與相應的配體結合的問題。

1.2NR1E成員SmE78 Wu等在曼氏血吸蟲得到了一個新的與果蠅蛻皮激素誘導蛋白78類似的核受體SmE78[9]。 對該受體在血吸蟲各個發(fā)育時期的mRNA表達水平進行檢測，結果表明其在蟲卵和毛蚴階段表達量較高。早前的研究表明曼氏血吸蟲可以合成固醇類的蛻皮激素并且該激素可以有效地刺激血吸蟲毛蚴在宿主體內的定殖[10-11]。血吸蟲的核受體SmE78是否與蛻皮激素信號轉導相關還需要試驗的證實。

1.3NR1J成員SmCAR和SmHR96β Hu等獲得了曼氏血吸蟲CAR受體的基因全長序列，它在DNA結合區(qū)域包含一個典型的P-box,其與AGTGCA可高效結合。該基因與果蠅的核激素受體96(DHR96)同源，酵母雙雜交和Pull-down 及免疫共沉淀試驗顯示SmCAR可以與SmRXR1結合，但不能與SmRXR2結合[12]。EMSA試驗顯示SmCAR可以與曼氏血吸蟲的P14雌蟲特異性基因上游序列結合。該受體在血吸蟲各個發(fā)育時期的mRNA均表達，但在蟲卵和毛蚴階段表達量較高。SmCAR蛋白在雌雄蟲的亞皮層和實質細胞中均有表達。另外在成熟雌蟲的卵巢、蟲卵和卵黃細胞中均有發(fā)現(xiàn)[13]。Wu 等[7]基于一個編碼DBD結構域的部分cDNA序列鑒定出了與果蠅的核激素受體96(DHR96)同源另一個基因SmHR96β。

1.4NR1的其他成員 進化樹分析顯示SmNR1與NR1家族成員屬于同類，但不屬于任何組[14]。SmNR1有兩個不同的剪輯方式，兩個不同的剪輯都可以編碼相同的氨基酸。熒光原位雜交顯示SmNR1位于血吸蟲一號染色體。酵母雙雜交和GST-Pull down試驗顯示SmNR1可以和SmRXR1相互作用。EMSA試驗顯示SmNR1和SmRXR1異源二聚體可以與包含AGGTCA的DNA元件(DR0-DR5Pal0)結合，包括p14-DR17在內[15]。突變分析顯示一個可以與SmFTZ-F1互作的共調控子SmCBP1能夠介導SmNR1和SmRXR1的LBD區(qū)的相互作用[16-17]。瞬時轉染哺乳動物COS-7細胞系顯示SmNR1/SmRXR1可以提高DR2依賴的報告基因的轉錄激活作用[14]。

1.5NR2B成員SmRXR1和SmRXR2 曼氏血吸蟲中存在兩個哺乳動物RXR同源的SmRXR1和SmRXR2[18-20]。RXRs通過形成異源二聚體，在調控核受體活性和核受體信號通路中承擔重要作用[20]。SmRXR1可以與很多蛋白形成異源二聚體。SmRXR1不但可以與包含AGGTCA的DNA元件(DR0-DR5Pal0)微弱地結合，還能夠與SmP14基因的順式作用元件結合[20]。SmNR1和SmRXR1異源二聚體可以與包含AGGTCA的DNA元件(DR0-DR5Pal0)結合[14]。QRT-PCR顯示，SmRXR1在蟲體各個階段均有組成性的表達[20]。共調控子SmCBP1能夠介導SmNR1和SmRXR1的相互作用[17]。

Freebern等成功擴增到了SmRXR-2基因，指出其在曼氏血吸蟲體內可持續(xù)性表達，毛蚴和尾蚴中的表達量較高。但是SmRXR-2的蛋白表達情況與mRNA表達結果相反，童蟲中該蛋白的表達量最高，而毛蚴和尾蚴中相比則低的多[18-19]。Fantappie 等針對曼氏血吸蟲RXR受體(SmRXR1和SmRXR2)特性及組織分布表達進行了研究[21]。與SmRXR1不同，SmRXR2無法與SmTRa、SmTRb、SmCAR和SmNR1形成異源二聚體。SmRXR2無法與保守的直接重復反應元件結合，蟲體天然的SmRXR2蛋白也不能轉錄激活哺乳動物細胞中的基因報告基團[19]。但是，酵母雜交實驗顯示SmRXR2可以與曼氏P14上游區(qū)域的順式元件相結合。酵母雙雜交及免疫共沉淀顯示SmRXR1和SmRXR2無法形成二聚體[21]。

1.6NR2C成員 SmTR2/4 SmTR2/4(睪丸孤核受體2/4)在曼氏血吸蟲體內可持續(xù)性表達，其中尾蚴中的表達量最高。免疫印記分析得到兩個SmTR2/4蛋白的同工異構體，分子量大小分別為230和245道爾頓。EMSA試驗顯示SmTR2/4的DBD結構域可以與包含兩個AGGTCA的DNA元件(DR3和DR4)結合。酵母單雜交顯示A/B,D和F區(qū)各自都含有轉錄激活的特性[22]。

1.7NR4A成員SmNR4A Wu等在曼氏血吸蟲得到了一個新的核受體亞家族成員SmNR4A，該受體因在LBD結構域含有4個保守的苯基丙氨酸，推測其可能為孤核受體。QRT-PCR顯示SmNR4A在子胞蚴階段和35天成蟲中表達量最高[23]。

1.8NR5A成員SmFTZ-F1a Lu 等在2006年分離鑒定了一個屬于NR5A家族的SmFTZ-F1a核受體，半定量RT-PCR顯示該基因在蟲卵階段的表達量最高。免疫印記分析得到分子量大小分別為206和120道爾頓的蛋白[24]。EMSA試驗顯示SmFTZ-F1a可以以單體形式與能被類固醇發(fā)生因子(SF-1)識別的FF1RE反應元件結合[25]。酵母單雜交實驗顯示SmFTZ-F1a轉錄激活報告基因的表達是A/B區(qū)域依賴性的。

1.9NR5B成員SmFTZ-F1 進化樹分析表明SmFTZ-F1屬于NR5B家族成員。目前已經(jīng)鑒定出兩個SmFTZ-F1的可變剪輯。RT-PCR顯示SmFTZ-F1在各個階段均有表達，在毛蚴、胞蚴和尾蚴階段的表達量較高。但蛋白是在尾蚴、童蟲和雄性成蟲階段的表達量比較高。EMSA試驗顯示SmFTZ-F1可以與SF-1的反應元件和SFRE的DR0結合，但不能和DR1、DR2、DR3、DR4及DR5結合。SmFTZ-F1可以激活轉錄哺乳動物細胞系的一個報告基團[26]。Bertin 等研究顯示SmFTZ-F1孤核受體的D、E和F區(qū)可以特異性地與SmRXR1的LBD相作用，暗示NR5B家族成員可以與其結合形成二聚體[27]。共轉CV-1細胞顯示SmFTZ-F1和SmRXR1能共激活轉錄，但只有SmFTZ-F1能結合到啟動子區(qū)域[26]。功能分析顯示SmCBP1能與SmFTZ-F1相互作用[16]。

1.102DBD-NRs家族成員Sm2DBD-NRa、Sm2DBD-NRβ和Sm2DBD-NRr 曼氏血吸蟲核受體的一個最顯著特點是分離出一個新的家族，這個家族包含了兩個DBD結構域和一個LBD結構域[7,28]。熒光原位雜交顯示這三個2DBD-NRs家族成員分別定位于不同染色體。RT-PCR顯示：Sm2DBD-NRa在胞蚴、尾蚴、童蟲、雌蟲和雄蟲階段能檢測出來；Sm2DBD-NRβ在蟲卵、胞蚴、尾蚴和雄蟲階段表達量相對較高；而Sm2DBD-NRr只在尾蚴和28天蟲體中能檢測到。酵母雙雜交顯示，Sm2DBD-NRa可以形成同源二聚體，但是未能與SmRXR1和SmRXR2形成異源二聚體。GST-Pull down試驗證實了在體外Sm2DBD-NRa的LBD區(qū)可以形成同源二聚體[28]。Sm2DBD-NRa以同源二聚體的形式相互作用，暗示了四個P-盒都與DNA的結合相關，2DBD-NR結合靶基因順式元件可能利用了新的DNA結合機制。

2 日本血吸蟲核受體家族(NR)成員

Wu等認為與曼氏血吸蟲相比，日本血吸蟲除了多一個到兩個2DBD-NR家族成員外，其他核受體的成員與曼氏血吸蟲的類似[7]。而劉峰等[29]在日本血吸蟲序列中發(fā)現(xiàn)類固醇激素受體(GR)，蛻皮激素樣受體(EcR)和雌激素相關受體(ERR)。這些受體在曼氏血吸蟲中是不存在的。Wu等重新分析了日本血吸蟲的基因組DNA序列后認為日本血吸蟲“蛻皮激素樣受體”是曼氏血吸蟲同源的CAR受體；而日本血吸蟲“雌激素相關受體”實際不是核受體[5]；至于日本血吸蟲“類固醇激素受體”(Sjp_0026760, Sjp_0002350)實際上是與曼氏血吸蟲同源的RXR1受體。

2.1NR1A成員SjTHRβ Qiu[30]等通過RACE技術從日本血吸蟲中成功擴增到SjTHRβ的cDNA序列，并且體外原核表達了SjTHRβ-DBD和SjTHRβ-LBD重組蛋白。經(jīng)EMSA試驗顯示SjTHRβ-DBD可以與保守的DNA半位點AGGTCA寡核苷酸探針結合。體外原核表達的rSjTHRβ-LBD蛋白可以在一定程度上保護小鼠免受日本血吸蟲尾蚴的感染。

2.2NR2B成員SjRXR1和SjRXR2 Qiu[31-32]等通過RACE技術從日本血吸蟲中成功擴增到SjRXR1和SjRXR2的cDNA序列。他們體外原核表達了SjRXR1-LBD重組蛋白并制備了該蛋白的多抗血清。該試驗推測真核表達的SjRXR1-LBD蛋白，可能可以與9-cisRA結合[31]。

3 結 語

目前曼氏血吸蟲、日本血吸蟲和埃及血吸蟲這三個物種的基因組測序都已經(jīng)完成[29，33-34]。對比曼氏和日本血吸蟲基因組中的編碼核受體序列，發(fā)現(xiàn)這兩個物種擁有類似的核受體成員[5,7]。但到目前為止，還沒有有關埃及血吸蟲的核受體成員的報道。同樣地湄公血吸蟲、馬來血吸蟲、間插血吸蟲的核受體成員也未見相關報道。

學者們試圖通過研究激素對寄生蟲的作用，來闡述哪種激素對血吸蟲的生長發(fā)育有直接的影響，及是否通過激素受體起作用。因配體結合受體特異性的存在，為精確地干擾寄生蟲生化途徑提供了可能，這意味著這些核受體蛋白有可能作為潛在的藥物靶標。曼氏血吸蟲、日本血吸蟲和埃及血吸蟲基因組測序的相繼完成，對研究者們理解血吸蟲的核受體的進化及其功能方面提供重要基礎。盡管Wang等[35]在生物學、藥理學及結構特性方面對寄生線蟲核受體DAF-12的作用通路做了探討和報道，但我們對寄生蟲核受體和其調控子的生物學功能和作用機制的了解還是很不充分的[36]，還有待于繼續(xù)深入研究。

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