多重PCR快速檢測惡性瘧和間日瘧的研究

李 歡，孫 菲，文 嵐，王曉春

瘧疾是最嚴(yán)重的全球性公共健康問題之一，世界上超過一半的人口生活在瘧疾流行區(qū)。近年來我國輸入性瘧疾呈逐年上升趨勢，2011年[1]全國27個省(市、區(qū))報(bào)告病例數(shù)4 479例，輸入病例占66.4%，死亡病例33例。湖南省報(bào)告148例，主要為惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum，P.f)和間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax，P.v)感染。目前我國仍采用顯微鏡檢法作為診斷瘧疾的“金標(biāo)準(zhǔn)”，顯微鏡檢法受鏡檢人員的主觀判斷及責(zé)任心影響，極容易漏診，延誤治療。為提升對瘧疾病例的實(shí)驗(yàn)室復(fù)核和確診能力，近年來以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)發(fā)展迅速。污染風(fēng)險低、靈敏度及特異性高的Real-time PCR[2]需要昂貴的儀器及試劑，難以在基層疾控部門推廣。本研究通過對多重PCR與傳統(tǒng)顯微鏡檢法的比較，旨在建立一種簡便快速、適于在基層疾控部門推廣的瘧疾確診方法。

1 材料與方法

1.1樣本與試劑 本研究采用的樣本包括DNA樣本和全血標(biāo)本。惡性瘧原蟲(3D7)、間日瘧原蟲(Sal-1)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae，P.m)(Uganda I)及卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale，P.o)(Nigeria I)DNA由長沙市疾控中心惠贈。從長沙市芙蓉區(qū)疾控中心、長沙市疾控中心、中南大學(xué)湘雅醫(yī)院、中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院、中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院等收集疑似瘧疾臨床全血標(biāo)本共86份，血片由湖南國際旅行衛(wèi)生保健中心同一專家進(jìn)行顯微鏡檢診斷。DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，PCR試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，pGM-T克隆試劑盒與質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì) 從GenBank檢索P.f和P.v的18S rRNA序列，結(jié)合參考文獻(xiàn)[3]用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行BLAST序列比對驗(yàn)證引物特異性。引物由上海生工生物有限公司進(jìn)行合成及ULTRAPAGE純化。引物序列見表1。

表1 多重PCR引物序列

1.2.2DNA的提取 吸取100 μL EDTA抗凝全血于1.5 mL eppendorf管中，用QIAGEN的QIAamp DNA Micro Kit試劑盒按照說明書提取DNA，經(jīng)過裂解、上柱吸附、脫鹽等步驟，最后用100 μL elution buffer洗脫DNA。用瓊脂糖凝膠電泳法及紫外分光光度法檢測所提DNA的純度及濃度。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3單重PCR 將引物稀釋至10 μmoL/L，對引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：2×Taq Master Mix(含染料)25 μL，引物PRvf 0.5 μL，引物PRv或PRf 0.5 μL，DNA 5 μL，用RNase-Free ddH2O補(bǔ)足50 μL。對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃結(jié)束PCR擴(kuò)增。取PCR產(chǎn)物6 μL，用25 g /L 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增結(jié)果?；厥?、純化PCR產(chǎn)物，送至上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4多重PCR 將P.f DNA與P.v DNA按照1∶1的比例混合，標(biāo)為Pvf。對引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：2×Taq Master Mix(含染料)25 μL，引物PRvf 1.0 μL，引物PRv 0.5 μL，引物PRf 0.5 μL，DNA 5 μL，用RNase-Free ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件同單重PCR。

1.2.5最低檢測限檢測 將P.f、P.v的擴(kuò)增片段分別插入pGM -T 載體，按試劑盒說明書進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和篩選，進(jìn)行菌落PCR初步驗(yàn)證插入片段是否正確，提取陽性質(zhì)粒DNA，用紫外分光光度計(jì)測定核酸濃度，并計(jì)算每微升的拷貝數(shù)。以質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10倍梯度稀釋。分別取濃度為101～ 107copies /μL 的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR，25 g /L 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物的檢測。

1.2.6臨床標(biāo)本的檢測 對86例臨床全血標(biāo)本進(jìn)行多重PCR檢測，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件與上文相同。多重PCR檢測結(jié)果與湖南國際旅行衛(wèi)生保健中心的顯微鏡檢結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，采用配對四格表資料χ2檢驗(yàn)。P<0.05為兩種方法有差別。以鏡檢法為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算多重PCR檢測臨床標(biāo)本的靈敏度等指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1DNA純度及濃度 紫外分光光度法測得所有DNA樣本A260/A280均在1.8～2.0之間，表明DNA純度較高。

2.2PCR檢測結(jié)果 單重PCR可擴(kuò)增出431 bp(P.f)和341 bp(P.v)目的條帶。多重PCR能擴(kuò)增出模擬混合感染標(biāo)本Pvf，P.m及P.o無條帶，特異性好。見圖1。

圖1單重與多重PCR產(chǎn)物條帶

Fig.1ProductbandsofsinglePCRandmultiplexPCR

1: Single PCRP.f(431 bp); 2: Single PCRP.v(341bp); 3: Multiplex PCRP.f; 4: Multiplex PCRP.v; 5: Multiplex PCR pvf; 6:P.m;

7:P.o; 8: NTC; M: Marker

2.3最低檢測限檢測 對P.v質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR檢測的凝膠電泳圖顯示，體系中標(biāo)準(zhǔn)品濃度為103copies/μL時仍有明顯條帶，該反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為102copies/反應(yīng)。見圖2。

圖2間日瘧原蟲梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的PCR產(chǎn)物條帶(341bp)

Fig.2PCRproductbandsofP.vgradientdilutedstandardplasmids

M: Marker; 1: 107copies/μL; 2: 106copies/μL; 3: 105copies/μL; 4: 104copies/μL; 5: 103copies/μL; 6: 102copies/μL; 7: 101copies/μL; 8: NTC.

2.4臨床標(biāo)本檢測 對86例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，兩種方法檢測結(jié)果的比較見表2。鏡檢法檢出40例P.f(見表3)、22例P.v(見表4)，多重PCR檢出45例P.f、20例P.v。

表2 兩種方法檢測結(jié)果比較

Note: χ2=0.364，P=0.549>0.05，兩種方法檢測結(jié)果無差別。

表3 兩種方法檢出P.f的比較

Note:P=0.180，P>0.05，兩種方法檢出P.f的結(jié)果無差別

3 討 論

瘧疾是一種極具破壞性的寄生蟲病，且近年來P.f對多種抗瘧藥產(chǎn)生抗藥性，宿主蚊亦對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性。及時、準(zhǔn)確的診斷對實(shí)現(xiàn)瘧疾的控制與消除計(jì)劃具有重要意義。瘧疾的確診有賴于實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)診斷，傳統(tǒng)的鏡檢法結(jié)果受諸多因素影響，容易誤診或漏診，作為“金標(biāo)準(zhǔn)”已越來越難于評價診斷效率[4]。本研究所采用的多重PCR法可快速檢測出是否存在瘧原蟲感染，并可單管多檢，通過一次檢測即可鑒別P.f與P.v，兩種瘧原蟲目的片段長度相差90 bp，通過瓊脂糖凝膠電泳后容易分辨。操作簡便，快速經(jīng)濟(jì)，不需要昂貴的儀器與試劑。相對于real-time PCR[5]更適合在基層疾控部門應(yīng)用。與Singh B等[6]所述的巢式PCR相比較操作更簡單、更快速。我國瘧疾患者P.f與P.v感染較常見，而P.f對氯喹等耐藥，若缺乏及時有效的治療很容易轉(zhuǎn)化為兇險型發(fā)作，危及生命。因此對P.f與P.v進(jìn)行鑒別對醫(yī)生正確使用抗瘧藥，瘧疾患者得到有效治療有著重要的意義。

表4 兩種方法檢出P.v的比較

Note:P=0.754，P>0.05，兩種方法檢出P.v的結(jié)果無差別。

在本研究中，對多重PCR反應(yīng)的引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化了反應(yīng)條件下，對4種感染人的瘧原蟲DNA進(jìn)行檢測，能檢出P.f和P.v，不常見的P.o和P.m無特異性條帶。對梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示最低檢測限為102copies/反應(yīng)，與以往報(bào)道[7-8]所述多重PCR的最低檢測限相同。

對臨床標(biāo)本檢測結(jié)果顯示多重PCR敏感度高，陽性預(yù)測值與陰性預(yù)測值均大于80%。該方法特異度僅為70.83%，主要是由于多重PCR可檢出102copies/反應(yīng)的瘧原蟲，但原蟲密度低時(<50/μL)鏡檢法容易漏診[9]。本研究不足之處在于沒有條件對結(jié)果不一致的標(biāo)本用鏡檢法進(jìn)行復(fù)檢。郭傳坤[10]等對PCR法與鏡檢法結(jié)果不一致的血片進(jìn)行復(fù)檢證實(shí)多數(shù)屬于鏡檢法的誤判。因此，原蟲密度低時若只進(jìn)行顯微鏡檢易漏診，延誤治療。本研究所采用的多重PCR同時檢測P.f和P.v的方法，無需昂貴的儀器與試劑，操作簡便、相對快速經(jīng)濟(jì)，對這2種瘧原蟲感染具有確診價值，為基層疾病控部門進(jìn)行瘧疾的流行病學(xué)調(diào)查提供手段，有助于及早發(fā)現(xiàn)瘧疾患者，并準(zhǔn)確分型，為臨床用藥及療效觀察提供參考。

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