去泛素化酶BRCC36功能的研究進展

李如君， 龔開政， 張振剛

去泛素化酶是自然界中廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一種生物活性酶，它與泛素化酶的作用相反，可將泛素或泛素鏈從底物上去除。BRCC36(BRCA1-BRCA2-containing complex subunit 36)是2003年發(fā)現(xiàn)的去泛素化酶家族新成員，屬于 JAMM(Jab1/MPN/Mov34 metalloenzyme)/MPN+(Mpr1/Pad1 N-terminal)亞類，參于DNA損傷修復、細胞信號轉導及細胞周期控制等多種細胞活動，在腫瘤發(fā)生、血管生成、抗心肌損傷過程中均發(fā)揮重要作用。不同于泛素化酶的種類繁多、可作用于某一特定環(huán)節(jié)，人體內(nèi)的去泛素化酶僅發(fā)現(xiàn)不到80種，提示其具有多種生物學功能。目前關于去泛素化酶BRCC36的研究還存在爭議，因此研究去泛素化酶的結構、作用形式、生理學功能可望給疾病新型治療靶點的探索提供必要的信息，具有較大的臨床意義。

1 BRCC36的結構和歸屬

BRCC36是由BRCC3基因編碼，含316個氨基酸，分子量為36 kD的多肽［1］。最初發(fā)現(xiàn) BRCC36是BRCA1-BRCA2-containing complex(BRCC)中的一個亞基，其基因位于人類X染色體長臂28區(qū)，該蛋白又被稱為C6.1A、CXorf53或 RP11-143H17.2。不同于泛素化酶可以催化底物蛋白進行泛素化修飾，該蛋白是一種相反的可以特異性從底物蛋白上移除聚泛素鏈的酶，即去泛素化酶(deubiqui-tinating enzymes，DUBs)。到目前為止人類已發(fā)現(xiàn)了600余種泛素化酶，但去泛素化酶僅有不到80種，這也意味著去泛素化酶功能的調(diào)控可能與其相連接的蛋白質有關。根據(jù)同源性，去泛素化酶目前可分成5大類，即泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs)、泛素特異性蛋白酶家族(ubiquitin-specific proteases，USPs)、卵巢腫瘤結構域蛋白酶(ovarian tumor domain proteases，OTUs)、Josephin 和JAMM/MPN+蛋白酶家族［2］。除了 JAMM/MPN+蛋白酶家族是金屬肽酶外，其余4類去泛素化酶均屬于半胱氨酸蛋白酶。BRCC36是JAMM/MPN+蛋白酶家族成員之一，目前該家族中被報告的其它成員有26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基14［26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 14;一種人類PAD1(proteasome alpha subunit 1)的類似物，在酵母細胞中的同源物被稱為 Rpn11］［3］、CSN5(COP9 信號體亞基)［4］、與胞內(nèi)分選復合物運輸相關(ESCRT machinery-associated)的去泛素化酶AMSH(associat-ed molecule with the SH3 domain of STAM1)和AMSHLP(AMSH-like protease)［5］。該家族 DUBs的特點是含有JAMM/MPN+結構域，其中包含2個組氨酸殘基和1個天冬氨酸殘基，可與二價鋅離子穩(wěn)定結合形成催化中心，發(fā)揮去泛素化作用［6］。BRCC36可特異性識別泛素間通過第63位賴氨酸殘基(K)連接形成的泛素鏈，并對其進行水解從而減弱靶物的泛素化修飾程度，其余成員均具有特異性水解K63位聚泛素鏈的功能［7］。研究已證實，通過K63位點連接的聚泛素鏈所介導的泛素化修飾在DNA損傷修復［8］、NF-κB 信號轉導［9］、細胞周期和核糖體功能控制［10］、蛋白質靶向運輸［11］中發(fā)揮重要作用。

2 BRCC36參與形成的復合物

在細胞內(nèi)，BRCC36主要通過參與 BRCC和BRISC(BRCC36-containing isopeptidase complex)這2種復合物的形成來發(fā)揮作用。免疫染色顯示BRCC復合物定位于細胞核，由 BRCC36、BRCA1、BRCA2、Merit40/NBA1、 BARD1、 RAD51、 BRCC45/BRE、RAP80和Abraxas/CCDC98等亞基組成;BRISC復合物則定位于細胞質，由 BRCC36、BRCC45/BRE、Merit40/NBA1和Abro1/KIAA0157亞基組成，2種復合物中的 Abraxas(即 CCDC98)和 Abro1(即KIAA0157)分別分布在胞核和胞質，其動態(tài)平衡可共同調(diào)節(jié) BRCC36的活性及細胞內(nèi)定位［8］。Feng等［2］研究顯示，敲除內(nèi)源性 Abraxas可導致胞核內(nèi)BRCC36水平顯著下降;而消減Abro1則使胞質中BRCC36含量顯著減少，但胞核內(nèi)無明顯變化。他們認為一方面與二者參與形成的復合物減少有關，另一方面與其可調(diào)節(jié)BRCC36同復合物中其它亞基的親和力有關。此外，機體還可通過調(diào)節(jié)2種復合物之間的比例來應對不同細胞事件對DUB活性的需要。例如通過下調(diào)Abro1導致胞質中BRISC復合物的減少、胞核中BRCC復合物相應增多，從而應對DNA損傷修復時對BRCC復合物的大量需求。Hu等［12］還發(fā)現(xiàn)，2種 BRCC36復合物共有組成亞基Merit40(即NBA1)和BRCC45(即BRE)的相互作用對維持復合物的完整性發(fā)揮關鍵作用。在細胞內(nèi)消減這2種亞基的任意一個都會引發(fā)復合物中其余亞基表達減少，且復合物的穩(wěn)定性降低，易被蛋白酶體降解。這是由于Merit40羧基端保守序列PXXR可通過與BRCC45羧基端第2個UEV(ubiquitin-conjugating enzyme variant)域相作用，共同維持BRCC36復合物的完整性;并且Merit40可促使BRCA1聚集在DNA損傷部位，參與BRCC復合物介導的DNA損傷修復。這表明，BRCC36通過與復合物中其余亞基的交互來發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)［8］，在BRISC復合物中，Abro1是BRCC36發(fā)揮作用的必需亞基;而缺乏BRCC45則無法探測出BRCC復合物具有DUB活性。研究者觀察到BRCC45的2個UEV域變異后并不影響其與其余亞基的相互作用，提示其通過其它途徑影響DUB活性，但具體機制尚待進一步研究。

3 BRCC36已知細胞生物學功能

由于目前僅發(fā)現(xiàn)不到80種去泛素化酶，提示去泛素化酶可參與多種代謝活動。其中BRCC36參與的K63位點去泛素化修飾調(diào)控，已被證實具有多種生物學功能。

3.1 參與DNA損傷修復 多種內(nèi)外源性理化、生物因素均會導致基因組發(fā)生損傷，人類每天會發(fā)生至少10 000處DNA損傷，尤其是DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks，DSBs)可導致基因突變、甚至細胞死亡。而細胞主要通過同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)來進行 DSBs修復工作［13］，研究表明 BRCC36均參與了上述過程。Block-Schmidt等［14］發(fā) 現(xiàn)，植 物 阿 拉 伯 芥 存 在BRCC36同源基因AtBRCC36A和AtBRCC36B。前者的突變會導致染色體之間及自身內(nèi)部出現(xiàn)嚴重的同源重組修復異常，而后者的突變則基本無影響，是否作為細胞內(nèi)BRCC36的冗余尚需進一步研究;但缺失任意一種BRCC36基因均會使得細胞對DNA交聯(lián)劑的敏感性下降，提示兩者在DNA交叉連接修復(DNA crosslink repair)中均起作用。此外還發(fā)現(xiàn)BRCC36發(fā)揮去泛素化作用要先于BRCA1的磷酸化，此點可作為研究BRCC復合物依賴的HR修復具體過程的依據(jù)。Coleman等［15］發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)缺失BRCC36會引起DSBs時核酸酶對DNA 5′端過度切除，并相應地引起依靠3′端突出段為模板的同源重組修復增強，這種過度的同源重組修復會損害基因組的完整性。

3.2 參與細胞周期調(diào)控 細胞在進行增殖時，通常會經(jīng)歷一個G2/M期關卡，用于檢測DNA是否存在缺陷。當關卡檢測到嚴重的缺陷及損傷時，細胞會暫時停止增殖，并啟動相應修復機制。若修復成功則繼續(xù)增殖，若修復失敗則啟動相應細胞死亡程序。BRCC36可降低關卡對DNA損傷的容忍度。Dong等［1］發(fā)現(xiàn)，消減細胞內(nèi)BRCC36和BRCC45的表達，會導致G2/M期關卡的作用消失。尤其是消減BRCC36至原先水平33%以下時，細胞將繞過自檢程序進入有絲分裂，導致DNA存在的缺陷遺傳給下一代細胞，使得子代抗損傷能力下降，生存能力明顯減弱。研究還發(fā)現(xiàn)散發(fā)性乳房腫瘤患者的腫瘤細胞中BRCC36異常高表達，表現(xiàn)為腫瘤細胞對放射治療不敏感;而消減BRCC36卻使得細胞對電離輻射的敏感性增強［16］。這與 BRCC36增強了關卡對DNA損傷的檢查并啟動相應DNA修復有關。對于該點的深入研究，可成為提高癌癥患者放療療效的新靶點，BRCC36也有望成為檢測放療敏感性的新指標。

3.3 參與細胞內(nèi)信號轉導 經(jīng)典的轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)信號通路已被證實在細胞分化、增殖、遷移、免疫應答，炎癥反應中發(fā)揮重要作用［17-18］，由其是在慢性壓力負荷等致心肌肥厚因素刺激下，心肌內(nèi)TGF-β1表達顯著增加。而我們新近的研究顯示［19］，在肺動脈平滑肌細胞中，環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)可使胞漿內(nèi)的β2-微管蛋白扣押轉化生長因子β1通路胞內(nèi)主要效應蛋白Smad3，從而抑制該通路，并發(fā)現(xiàn)扣押時與Smad3，結合的BRCC36明顯增加，提示BRCC36可能通過調(diào)節(jié)Smad3的泛素化修飾來參與TGF-β1信號通路的調(diào)節(jié)。但目前國內(nèi)外尚無報道，我們現(xiàn)正對這一課題進行研究。此外，核因子κB(NF-κB)信號通路的研究證實［9］，對腫瘤壞死因子受體相關因子(TNF receptor-associated factor)2、6的K63位點泛素化修飾的移除，可負向調(diào)節(jié)該通路，提示BRCC36可通過對NF-κB通路關鍵轉換因子的去泛素化修飾來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

3.4 參與泛素化修飾調(diào)節(jié) BRCC36可特異性移除靶物K63位點的泛素，是其生物學功能的基礎。眾所周知，DNA損傷后可誘導 ATM/ATR使組蛋白H2AX的S139上發(fā)生磷酸化來招募MDC1因子，隨后MDC1磷酸化來促使泛素連接酶RNF8/UBC13和RNF168/UBC13在受損染色質部位連接上K63位點聚泛素鏈，為BRCC復合物創(chuàng)造出一個停泊位點，并促使 BRCA1向此部位聚集［12］。BRCC復合物中Rap80的串聯(lián)泛素作用域(ubiquitin interaction motif，UIM)可特異性識別K63位點聚泛素鏈修飾的染色質，介導修復因子的定位［20］。而修復完成后泛素化信號的及時解除至關重要。研究指出［21］，Rap80通過介導復合物中BRCC36在DNA受損部位定位，通過BRCC36特異性水解K63位點聚泛素鏈來提供損傷修復后的終止信號，從而解除G2/M期關卡對細胞周期的阻滯，使細胞恢復增殖能力。在胞質中，雖然BRCC36參與了BRISC復合物的組成，但該復合物對連接在K48、63位點的聚泛素鏈親和力相同。之所以BRISC復合物僅水解K63位點聚泛素鏈，并非由于其特異性識別該聚泛素鏈，而是由于底物與酶催化部位連接的特殊構象。因為K63位點上形成的聚泛素鏈其內(nèi)部的異肽鏈構象有利于BRCC36發(fā)揮水解作用［22］。但有研究也發(fā)現(xiàn)，BRCC36還可增強特定泛素連接酶的活性，從而上調(diào)泛素化水平。例如BRCC36可能通過抑制BRCA1的底物或泛素交聯(lián)酶(E2)結合位點發(fā)生泛素化修飾，從而增強BRCA1復合物泛素連接酶(E3)活性達20倍［23］。因此，BRCC36的多功能形態(tài)值得進一步深入研究。

4 BRCC36與疾病的關系

越來越多的證據(jù)顯示BRCC36參與了多種疾病的發(fā)生過程。Chen等［16］研究發(fā)現(xiàn)，BRCC36在絕大多數(shù)的乳房腫瘤中異常高表達。消減腫瘤細胞內(nèi)BRCC36水平并不會影響細胞的正常生長，但給予一定劑量的電離輻射后，細胞凋亡明顯增加。這與缺乏BRCC36導致的BRCA1無法正常磷酸化及其無法在受損DNA部位形成修復核灶有關。Cilenti等［24］研究發(fā)現(xiàn)，Abro1參與的 BRCC36調(diào)控可能是一種新型的心臟保護機制。他們在心肌梗死患者的病變心肌區(qū)域發(fā)現(xiàn)Abro1水平顯著增高。通過對心肌缺血再灌注損傷模型的研究顯示，增加Abro1會引起具有K63位點泛素化修飾的蛋白靶物顯著減少，可明顯減少氧化應激誘導的細胞凋亡;而降低Abro1的水平則相反，會加重由于缺血及再灌注所導致的心肌細胞損傷及凋亡。但作者并未指出K63泛素化修飾水平的下降與BRCC36有直接關系，需要進一步探索。此外，Singh通過對敲除了BRCC復合物中關鍵成份BRCA2的轉基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)［25］，當給予具有心臟毒性的抗腫瘤藥物多柔比星后，轉基因小鼠比野生對照鼠出現(xiàn)了更為顯著的心臟毒害反應，包括更為嚴重的心功能不全、全組死亡率提高及更為廣泛的DSBs和修復核灶形成明顯不足，左心室病理切片也反映出更多的心肌細胞凋亡。這與消減BRCC36引起的BRCC復合物減少導致的DNA損傷修復能力減弱一致。相關的研究還涉及了BRCA1在心力衰竭、缺血再灌注損傷中所起的作用，都表明減弱DNA的修復會導致更為嚴重的心臟病變。Miskinyte等［26］對綜合性煙霧病的研究發(fā)現(xiàn)，BRCC3基因的缺失，是導致該病發(fā)生的重要原因。通過基因敲除技術暫時去除斑馬魚的BRCC3基因也出現(xiàn)了血管形成障礙，而通過補充BRCC36則可逆轉這一現(xiàn)象，提示BRCC36在血管形成中發(fā)揮重要作用。

5 展望

綜上所述，BRCC36作為生物體內(nèi)為數(shù)不多的特異性K63位點去泛素化酶，參與多種細胞活動，在DNA修復、信號轉導、細胞周期控制、血管形成等調(diào)控中發(fā)揮重要作用;其調(diào)控主要通過與BRCC36復合物中其它亞基的相互作用而實現(xiàn);與乳房腫瘤、心臟缺血缺氧損傷、煙霧綜合征等疾病的發(fā)生聯(lián)系密切。對其深入研究，可成為提高腫瘤放療效果的靶點［16］和預測心臟疾病發(fā)生風險的敏感指標［27］，具有較強的臨床價值。

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