骨質(zhì)疏松癥動物模型的制作與評價＊

付小衛(wèi)，宋長恒，劉梅潔，于 崢，趙宏艷，張治國，張方珍，李岳澤

(1.陜西中醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院，陜西咸陽 712046;2.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量減少或(和)骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨骼疾病，表現(xiàn)為骨強度下降、骨脆性增加，從而極易發(fā)生骨折。骨質(zhì)疏松癥及由其引起的骨折等并發(fā)癥，對中老年人尤其是絕經(jīng)后婦女的身體健康和生存質(zhì)量構(gòu)成了嚴重威脅，并極大地增加了社會和家庭的經(jīng)濟和生活負擔。近20多年來，中醫(yī)藥工作者在大量臨床實踐經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，開展了廣泛的防治骨質(zhì)疏松癥的實驗研究工作，取得了較大的研究成果。本文簡述中醫(yī)藥科研中各種骨質(zhì)疏松癥動物模型的制作方法并進行評價。

1 去勢法

去勢法分為雌性去卵巢法和雄性去睪丸法。

1.1 去卵巢法

此法是20世紀60年代末由Saville利用實驗大鼠首次建立的［1］，目前已成為研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)典模型之一。大鼠雙側(cè)卵巢切除后的骨丟失，與婦女絕經(jīng)或卵巢切除后的骨丟失極為相似，都是由于體內(nèi)雌激素水平迅速降低，使其對成骨細胞的促成熟功能和對破骨細胞的抑制功能減弱，使骨代謝呈現(xiàn)負平衡，即骨吸收和骨形成都明顯增加，但骨吸收功能大于骨形成功能，以骨丟失為主，進而啟動了骨的合成，屬高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松。

鄺志強等［2］用6月齡雌性SD大鼠切除雙側(cè)卵巢8周后進行干預(yù)，干預(yù)12周后采用雙能X線檢測大鼠BMD，ELISA法檢測血清 RANKL、OPG含量，real-time PCR檢測大鼠骨組織RANKL、OPGmRNA表達。實驗結(jié)果顯示，與sham組比較，OVX組大鼠BMD降低，血清RANKL含量增加，OPG降低，骨組織RANKL mRNA表達增加，OPG mRNA表達減少。

1.2 去睪丸法

去睪丸大鼠骨質(zhì)疏松動物模型是研究男性骨質(zhì)疏松的重要工具。大量臨床資料證實，成年男性手術(shù)或藥物去勢造成的雄激素迅速降低，致使骨轉(zhuǎn)換增加骨量丟失，而激素替代療法可以逆轉(zhuǎn)這一狀況。雄激素具有抑制骨吸收促進骨形成的作用，主要是通過直接作用于成骨細胞上的雄激素受體和經(jīng)芳香化酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇贫及l(fā)揮作用。另外，雄激素缺乏也可減少降鈣素的分泌量，進而間接引起破骨細胞活性增加。

蘇開鑫等［3］對4月齡SD雄性大鼠切除睪丸90 d后觀察發(fā)現(xiàn)，去睪丸組大鼠脛骨上端骨量下降，骨形成和骨吸收參數(shù)都增加，骨代謝呈高轉(zhuǎn)換型，同時腰椎也出現(xiàn)骨質(zhì)丟失。

近年的研究也表明，雌激素在維持男性骨代謝平衡方面有著重要作用。切除睪丸后造成的骨量減少、骨質(zhì)疏松，到底是雄激素還是雌激素缺乏引起的，目前觀點尚不一致，有待今后深入研究探析。

2 給藥法

2.1 糖皮質(zhì)激素

大量臨床資料證實，長期或大量使用糖皮質(zhì)激素可以引致骨質(zhì)疏松且并發(fā)骨折。其發(fā)生機制是超生理劑量的糖皮質(zhì)激素可顯著抑制松質(zhì)骨的骨形成，增加骨吸收，使骨代謝呈現(xiàn)負平衡，進而導致OP，常用藥物有地塞米松、潑尼松龍等。趙旭等［4］采用此法造模研究左歸丸治療OP的效應(yīng)機制，給予SD大鼠地塞米松1 mg/kg肌肉注射，每周2次，連續(xù)8周，結(jié)果顯示模型組血清堿性磷酸酶升高，腰椎骨生物力學性能下降，股骨骨礦含量、BMD均下降，而中藥左歸丸可對以上指標有逆轉(zhuǎn)改善作用。

2.2 維A酸

維A酸又稱維甲酸，是體內(nèi)Vitamin A的代謝中間產(chǎn)物，臨床上主要用于治療腫瘤和銀屑病等，但其有致骨質(zhì)疏松的副作用。有文獻報道［5］，此藥既有促進成骨細胞增殖和分化作用，又能增加破骨細胞的骨吸收，故而可造成骨形成與骨吸收都活躍的高轉(zhuǎn)換型OP。西安交通大學許鵬等［6］研究表明，給予維甲酸15 d時模型組大鼠血清雌二醇水平明顯降低，其機制有可能是損傷大鼠卵巢，使雌激素分泌減少，進而減低對破骨細胞的抑制作用，造成骨吸收明顯增強。

2.3 D-半乳糖

1985年，有學者［7］運用其建立衰老模型。后研究發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖可致雄性大鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松，主要機制是其可損害雄性大鼠的睪丸，使雄激素降低。戴娟秀等［8］研究指出，D-半乳糖大量在細胞內(nèi)堆積可使細胞滲透壓升高、脆性增加，并可產(chǎn)生大量氧自由基，進一步使細胞老化和功能減退，在雄性大鼠實驗中，可使大鼠睪丸支持細胞和生精細胞發(fā)生損傷，血清睪酮下降，從而使破骨細胞活性增加，抑制鈣的腸吸收并增加鈣磷排泄，最終導致OP，但D-半乳糖對雌性大鼠不能導致骨質(zhì)疏松［9］。

2.4 環(huán)磷酰胺

環(huán)磷酰胺是一種烷化劑，具有明顯的抗癌和免疫抑制作用，臨床多用于惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴細胞白血病等腫瘤性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病。其作用機制可能與其免疫抑制作用、促進骨鈣釋放、抑制骨羥脯氨酸的合成及骨鈣的沉積有關(guān)，因而此法建立的OP模型具有骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)等比例減少的特點。曹勝男等［10］采用此法進行造模研究，給予小鼠此藥20 mg/(kg·d)連續(xù)灌胃，2周即可使小鼠骨干重減少，股骨長和橫徑減少，骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)同時減少，建立OP模型。

2.5 谷氨酸單鈉

谷氨酸單鈉俗稱味精，是對健康有害的食品添加劑之一。作為一種中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，大量文獻證實其具有神經(jīng)毒性作用，給新生期大鼠皮下注射谷氨酸單鈉可損毀下丘腦弓狀核而導致骨質(zhì)疏松。鐘平等［11］給予新生期SD雌性大鼠皮下注射10%谷氨酸單鈉，4個月后進行骨組織形態(tài)計量學檢測，結(jié)果顯示實驗組與生理鹽水對照組比較，骨形成減少，骨吸收增加，骨量減少，導致骨質(zhì)疏松發(fā)生。

3 營養(yǎng)干預(yù)法

此法主要是控制動物飼料中鈣和蛋白的含量。鈣是骨骼的基本成分，人體中99%的鈣存在于骨骼中。長期的低血鈣可使機體處于負鈣平衡狀態(tài)，從而繼發(fā)引起甲狀旁腺功能亢進，PTH分泌增多，導致骨量丟失，發(fā)生OP。流行病學調(diào)查顯示［12］，人群中蛋白質(zhì)攝入量與骨密度呈顯著負相關(guān)，其主要原因是高蛋白攝入使尿中固定酸含量增加，腎近曲小管對鈣的重吸收減少，從而使鈣從尿液中流失增加。

復旦大學王燁明等［13］通過采用對3周齡SD大鼠攝食低鈣高蛋白飼料造模，6個月后實驗組大鼠即出現(xiàn)骨小梁面積減少、變窄、間距增寬、斷裂，骨代謝提示破骨細胞活性顯著增加，成骨細胞功能也變活躍，呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)換骨質(zhì)疏松。

4 疾病并發(fā)癥

4.1 糖尿病性

流行病學調(diào)查表明，糖尿病患者易發(fā)生骨質(zhì)疏松。其發(fā)生機制主要有胰島素缺乏、糖代謝紊亂、微血管病變3方面，以及胰島素對骨的影響通過直接作用或由生長因子(IGF-1)介導。薛昊罡等［14］研究AGEs對糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松的作用機制，取SD大鼠腹腔內(nèi)注射STZ，誘導建立糖尿病骨質(zhì)疏松動物模型，結(jié)果顯示模型組大鼠的骨組織形態(tài)計量學參數(shù)靜態(tài)指標和動態(tài)指標與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松表現(xiàn)。

4.2 肝硬化性

近年來臨床觀察發(fā)現(xiàn)［15］，膽汁瘀積性肝病可并發(fā)骨質(zhì)疏松，其發(fā)生機制尚未完全明了，目前認為與肝內(nèi)膽汁瘀積使腸腔內(nèi)膽鹽減少，引起維生素D、鈣吸收障礙有關(guān)。鄒麗宜等［16］用四氯化碳致小鼠肝纖維化制造肝硬化模型，測定右股骨干重和股骨總鈣含量減少，提示有骨量丟失，同時血清白蛋白明顯減少，球蛋白明顯增加，此骨量丟失或許與蛋白紊亂有某種聯(lián)系。

4.3 酒精中毒性

長期過量飲酒所致的酒精中毒可引發(fā)骨質(zhì)疏松，屬于低轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥［17］。酒精可影響骨代謝，使骨吸收增強，骨形成減少、骨量降低而引發(fā)OP。任樹軍等［18］給予雄性SD大鼠紅星二鍋頭灌胃法造模，16周后取材行雙能X線骨密度儀檢測左側(cè)股骨BMD和BMC，結(jié)果二者均明顯低于正常對照組，說明造模成功。

5 制動法

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，某些疾病患者因為運動受限和功能障礙一段時間后，可出現(xiàn)骨礦含量減少、骨小梁變細，甚至關(guān)節(jié)疼痛、變形、駝背、脊柱側(cè)彎等骨質(zhì)疏松表現(xiàn)，可稱之為失用性骨質(zhì)疏松。據(jù)此，可以制作OP動物模型用于科學研究，常用的方法有腿-尾固定法、尾掉法、坐骨神經(jīng)切斷法等。華西醫(yī)院唐學陽等［19］通過腿-尾固定法對4周齡SD雄性大鼠進行制動法建立OP模型，制動2周和4周后幼鼠右后肢股骨的濕重和灰重、股骨和脛骨BMD均低于同齡對照組。另外，制動2周時出現(xiàn)右側(cè)脛骨骨小梁稀疏，制動4周可見紐扣樣改變，髓腔增大。

6 基因敲除法

基因敲除技術(shù)是20世紀80年代創(chuàng)立的一門新技術(shù)，是采用一定方式在體外構(gòu)建載體，通過同源重組的方式刪除1個基因，此基因結(jié)構(gòu)已知功能未知，從而在細胞水平或動物水平觀察研究該基因的功能［20］。上世紀末即有報道［21］，利用骨保護素(OPG)基因敲除純合子小鼠可表現(xiàn)出嚴重的骨質(zhì)疏松癥。近年來，國內(nèi)學者也多有運用此法建立OP模型進行研究，如上海中醫(yī)藥大學程少丹等［22］采用頻密繁殖法獲得OPG基因敲除小鼠進行骨質(zhì)疏松研究，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松，是一種理想的骨質(zhì)疏松模型動物。

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