大黃素對(duì)腹腔嚴(yán)重感染大鼠血漿血小板活化因子和降鈣素原及一氧化氮水平的影響

高 舉，劉弋

目前，嚴(yán)重感染導(dǎo)致膿毒癥以及敗血癥的發(fā)生并最終出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征 (SIRS)合并免疫失控還缺乏切實(shí)可行的治療方法［1-6］。為探討血漿血小板活化因子 (PAF)、降鈣素原 (PCT)等內(nèi)源性遞質(zhì)以及一氧化氮 (NO)水平在發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)的變化，明確其與腹腔感染程度的相關(guān)性，通過干預(yù)前后水平變化來觀察大黃素能否通過降低血漿內(nèi)毒素水平來改變機(jī)體免疫反應(yīng)以及通過對(duì)腹腔嚴(yán)重感染狀態(tài)下自由基如:NO水平測(cè)定觀察這類藥物是否具有穩(wěn)定腹腔嚴(yán)重感染狀態(tài)時(shí)體內(nèi)自由基釋放-清除機(jī)制及氧化-抗氧化機(jī)制。為此，本實(shí)驗(yàn)通過制作腹腔嚴(yán)重感染模型，研究大黃素干預(yù)前后血漿PAF、PCT、NO水平的變化規(guī)律，為臨床有針對(duì)性地采取有效治療措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康無特定病原體級(jí) (SPF)雄性SD大鼠36只，年齡 (81．0±11．6)d，體質(zhì)量 (303±43)g(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前在中科院動(dòng)物飼養(yǎng)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，且經(jīng)中科院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，按照100 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉。

1．2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 大黃素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度＞98%，批號(hào):E8772。四磨湯為湖南漢森制藥有限公司生產(chǎn)，購(gòu)自航空總醫(yī)院藥房，批號(hào):1302118546，10 ml/支。頭孢他啶為哈藥集團(tuán)制藥總廠生產(chǎn)，購(gòu)自航空總醫(yī)院藥房，批號(hào)為:1301022，0．5 g/支。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)試劑盒購(gòu)自北京中昊時(shí)代生物科技中心。

1．3 方法

1．3．1 腹腔嚴(yán)重感染模型制備 腹腔嚴(yán)重感染是指合并膿毒癥與膿毒癥休克的腹腔感染，多發(fā)生于消化道穿孔、破裂等繼發(fā)性腹膜炎［7］。造模采用公認(rèn)的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù) (CLP)制作腹腔嚴(yán)重感染模型［8-9］。麻醉滿意后，取腹部正中縱行切口，逐層切開進(jìn)入腹腔，仔細(xì)辨別尋找盲腸，游離盲腸系膜過程中需注意避免損傷回盲腸血管，提起盲腸將其放置于腹腔外，保護(hù)腹腔防止污染。在盲腸中部約1/2處用0#絲線結(jié)扎后用16 G針頭在盲腸結(jié)扎線與盲腸末端中間行貫通性穿刺，穿刺過程中避免損傷血管。將少量盲腸內(nèi)容物從兩側(cè)針孔輕輕擠出，確保穿孔部位完全開放，制模過程中使每只大鼠擠出內(nèi)容物的量一致，再將盲腸還納入腹腔，分層縫合腹壁切口，術(shù)畢。術(shù)后各組動(dòng)物均自由進(jìn)食、飲水。術(shù)后每日靜脈推注頭孢他啶溶液(20 mg/kg)。

1．3．2 實(shí)驗(yàn)分組及治療 將36只大鼠隨機(jī)分為:空白組、對(duì)照組、大黃素組，每組12只?？瞻捉M:術(shù)后第1天開始0．9%氯化鈉溶液 (5 Ml/kg)灌胃，2次/d，連續(xù)3 d。對(duì)照組:術(shù)后第1天開始四磨湯 (5 ml/kg)灌胃，2次/d，連續(xù)3 d。大黃素組:術(shù)后第1天開始大黃素 (1．5 mg/kg)灌胃，2次/d，連續(xù)3 d。

1．4 血標(biāo)本的采集與檢測(cè) 腹腔嚴(yán)重感染大鼠治療前、治療后72 h從尾靜脈抽取靜脈血10 ml注入肝素抗凝無菌瓶中，4 000 r/min離心10 min，離心半徑84 mm，取上清液送檢。PAF、PCT、NO水平檢測(cè)采用ELISA法，采用Thermo Multiskan MK3公司的全自動(dòng)酶標(biāo)儀，以上操作方法均嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以 (±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

治療前，3組大鼠PAF、PCT、NO水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05)。治療后，3組大鼠PAF、PCT、NO水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0．05);其中對(duì)照組、大黃素組 PAF、PCT、NO水平較空白組降低，大黃素組 PAF、PCT、NO水平較對(duì)照組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0．05，見表 1)。

3 討論

目前，研究表明PAF、PCT、NO作為炎性指標(biāo)，廣泛運(yùn)用在腹腔嚴(yán)重感染的診斷和治療中［10-12］。PCT是一種人類降鈣素的前體物質(zhì)，PCT水平升高的幅度與全身細(xì)菌感染程度呈正相關(guān)。目前普遍認(rèn)為PCT較腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)等其他檢測(cè)指標(biāo)更靈敏、更準(zhǔn)確［10，13-14］。本實(shí)驗(yàn)中大黃素組與對(duì)照組均有治療效果，治療后PCT水平下降，但大黃素組較對(duì)照組治療效果更明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明大黃素能夠有效控制機(jī)體的炎性反應(yīng)。其作用機(jī)制與大黃素降低血中炎性遞質(zhì)水平聯(lián)合腸道去污降低全身細(xì)菌感染程度有關(guān)。

PAF是一種內(nèi)源性脂性遞質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)特性［15］。多數(shù)研究認(rèn)為PAF在諸多參與胃腸黏膜損害的炎性遞質(zhì)中起到“中心放大”的介導(dǎo)作用，誘導(dǎo)并加速炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展，其顯著增多可以產(chǎn)生中性粒細(xì)胞、活性氧、白三烯等大量炎性遞質(zhì)［16-19］。本實(shí)驗(yàn)中腹腔嚴(yán)重感染大鼠PAF水平升高也驗(yàn)證了PAF能夠誘導(dǎo)、啟發(fā)并且擴(kuò)大靶細(xì)胞的炎癥，大量炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生短時(shí)間內(nèi)激起炎性反應(yīng)發(fā)生，使得免疫自穩(wěn)態(tài)迅速遭到破壞，機(jī)體免疫自穩(wěn)態(tài)被打破從而引起免疫的亢進(jìn)或抑制，進(jìn)一步導(dǎo)致炎性反應(yīng)失控，最終引起多器官功能障礙。磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是一類廣泛存在于細(xì)胞膜的磷脂水解酶，催化甘油磷脂上二位 (Sn-2)不飽和酰酯鍵水解，形成一分子溶血卵磷脂和一分子游離脂肪酸，溶血卵磷脂繼而轉(zhuǎn)化為PAF［20-21］，大黃素降低PAF水平可能與其具備降低PLA2能力有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大黃素組與對(duì)照組治療后PAF水平下降，而大黃素組較對(duì)照組治療效果更明顯。

表1 3組大鼠治療前后PAF、PCT、NO水平比較 (±s)Table 1 Comparison of levels of PAF，PCT and NO among 3 groups of rats before and after treatment

注:PAF=血小板活化因子，PCT=降鈣素原，NO=一氧化氮;與空白組比較，*P＜0．05;與對(duì)照組比較，△P＜0．05

治療后空白組 12 2．51 ±0．21 2．48 ±0．25 147 ±15 146 ±15 10．45 ±1．32 9．90 ±1．25組別 只數(shù) PAF(ng/ml)治療前 治療后PCT(ng/ml)治療前 治療后NO(mmol/L)治療前對(duì)照組 12 2．48 ±0．30 2．26 ±0．25* 150 ±14 132 ±12* 10．82 ±1．56 7．50 ±0．83*大黃素組 12 2．65±0．25 2．15±0．22＊△ 145±15 116±11＊△ 10．32±1．06 6．20±0．75＊△F 值0．112 0．036 0．071 0．012 0．142 0．025 2．34 3．67 2．87 5．11 2．07 4．15 P值

NO是一種內(nèi)皮依賴性舒血管物質(zhì)，炎性反應(yīng)時(shí)會(huì)急劇增加，促進(jìn)炎性反應(yīng)發(fā)展，導(dǎo)致機(jī)體受損［22］。本實(shí)驗(yàn)中造模后NO水平明顯升高，NO的過度增加導(dǎo)致低血壓和低灌流的發(fā)生，并容易與超氧陰離子自由基的反應(yīng)生成細(xì)胞毒性物質(zhì)造成自由基損傷作用，促進(jìn)炎癥的發(fā)展，使得炎癥及免疫狀態(tài)無法自我調(diào)控恢復(fù)平衡狀態(tài)［23］。NO在體內(nèi)由NO合成酶 (NOS)催化底物左旋精氨酸產(chǎn)生。大黃素已經(jīng)被證明對(duì)NOS有較強(qiáng)的抑制作用，NO水平降低可能與大黃素通過抑制NOS的活性減少NO生成相關(guān)［24］。經(jīng)過正確的治療NO水平會(huì)明顯降低，使內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等靶細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素刺激和敏感性降低，使細(xì)胞因子及炎性遞質(zhì)造成的損傷易于控制，最終達(dá)到促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)的目的。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中按實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范進(jìn)行，模型制作按照通行盲腸結(jié)扎穿孔方法進(jìn)行［25］。抽血及給藥方法亦均按照實(shí)驗(yàn)規(guī)范進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為原始數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信，與目前開展的同類研究得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論基本符合。

嚴(yán)重感染極易引起膿毒癥發(fā)生，常誘發(fā)多器官功能障礙綜合征 (MODS)和SIRS的發(fā)生。目前，通常的治療為早期根據(jù)經(jīng)驗(yàn)采用廣譜抗生素治療同時(shí)做細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果卻是效果欠佳，產(chǎn)生耐藥性，超級(jí)細(xì)菌不斷涌現(xiàn)［1-4］，這為感染性疾病的治療帶來很大的挑戰(zhàn)［26］。目前，國(guó)外對(duì)SIRS的研究仍然集中于抗體拮抗劑、烏司他丁、血液凈化技術(shù)、糖皮質(zhì)激素、免疫營(yíng)養(yǎng)支持、炎性相關(guān)基因多態(tài)性等治療方法。目前還大多限于實(shí)驗(yàn)性研究，臨床上并沒有取得滿意的療效［27］。

大黃素是一種羥基蒽醌類的衍生物，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大黃素可以降低PAF、PCT等炎性遞質(zhì)，改善NO水平，控制炎性反應(yīng)，清除體內(nèi)蓄積的毒素，從而達(dá)到改善內(nèi)毒素血癥，調(diào)節(jié)體內(nèi)失控的免疫反應(yīng)的目的。提示通過抑制促炎細(xì)胞因子的生產(chǎn)從而降低炎性細(xì)胞因子和遞質(zhì)來達(dá)到控制炎性損傷，逐步恢復(fù)臟器功能目的。其機(jī)制為推進(jìn)肌肉收縮，引起腸道水分含量增加和黏液分泌增多導(dǎo)致腹瀉發(fā)生，從而清除炎性遞質(zhì)以及腸道內(nèi)積存毒素［23］，更關(guān)鍵的作用在于抑制脂多糖 (LPS)誘導(dǎo)促炎性反應(yīng)來控制炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)清除血液中炎性遞質(zhì)和氧自由基達(dá)到恢復(fù)臟器功能，減少機(jī)體損傷的目的［28-29］。為臨床上治療腹腔嚴(yán)重感染尋找新思路提供了理論依據(jù)。

目前，大黃素已被證明具有廣泛應(yīng)用前景，但對(duì)于其作用機(jī)制還處于探索階段，今后研究重點(diǎn)在于進(jìn)一步明確大黃素對(duì)炎性遞質(zhì)水平降低的具體機(jī)制，盡快開展臨床試驗(yàn)，使之能夠盡快應(yīng)用到臨床中來。

1 Leaver SK，MacCallum NS，Pingle V，et al．Increased plasma thioredoxin levels in patientswith sepsis:positive association withmacrophage migration inhibitory factor［J］．Intensive Care Med，2010，36(2):336-341．

2 Araújo-Filho I，Jácome DT，Rêgo AC，et al．Effect of the simvastatin in abdominal sepsis of diabetic rats［J］．Rev Col Bras Cir，2010，37(1):39-44．

3 Kibel S，Adams K，Barlow G．Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care ［J］．JAntimicrob Chemother，2011，66(Suppl 2):33-40．

4 Roy SK，Kendrick D，Sadowitz BD，et al．Jack of all trades:pleiotropy and the application of chemically modified tetracycline-3 in sepsis and the acute respiratory distress syndrome(ARDS)［J］．Pharmacol Res，2011，64(6):580-589．

5 Mancini N，Carletti S，GhidoliN，etal．The era ofmolecular and other non-culture-based methods in diagnosis of sepsis［J］．Clin Microbiol Rev，2010，23(1):235-251．

6 凌麗，肖雪，劉安平，等．煙堿預(yù)處理對(duì)全身炎癥反應(yīng)綜合征大鼠血漿細(xì)胞因子的影響研究［J］．實(shí)用心腦肺血管病雜志，2011，19(11):1871．

7 任建安，黎介壽．嚴(yán)重腹腔感染的綜合治療［J］．中國(guó)實(shí)用外科雜志，2007，27(12):940-942．

8 成紅剛，丁連安，曲林林，等．腹腔感染大鼠腸屏障功能損傷研究 ［J］．腸外與腸內(nèi)營(yíng)，2012，19(2):111-114．

9 Dejager L，Pinheiro I，Dejonckheere E，et al．Cecal ligation and puncture:the gold standard model for polymicrobial sepsis?［J］．Trends Microbiology，2011，19(4):198-208．

10 胡光友，葛香麗，孫貴貴．血清降鈣素原在危重患者感染診斷中的應(yīng)用 ［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23(18):4593-4595．

11 陳光暉，陳子珺，陳德興．蓄血證大鼠模型血清及血漿中炎癥及凝血指標(biāo)的研究 ［J］．上海中醫(yī)藥雜志，2013，47(6):93-97．

12 段文濤，馬海，楊紅春，等．重癥急性胰腺炎患者血清TNF-α、IL-6、PAF的臨床意義［J］．中華臨床醫(yī)師雜志:電子版，2013，7(17):8014-8015．

13 Azevedo JR，Torres OJ，Czeczko NG，etal．Procalcitonin as a prognostic biomarker of severe sepsis and septic shock ［J］．Rev Col Bras Cir，2012，39(6):456-461．

14 Kaya B，Sana B，Eris C，et al．The diagnostic value of D-dimer，procalcitonin and CRP in acute appendicitis［J］．International Journal of Medical，2012，9(10):909-915．

15 沈君，梁妤婷，左云龍，等．降鈣素原與小兒膿毒血癥相關(guān)性的研究［J］．中國(guó)臨床醫(yī)生，2013，41(2):52．

16 Yost CC，Weyrich AS，Zimmerman GA．The platelet activating factor(PAF)signaling cascade in systemic inflammatory responses ［J］．Biochimie，2010，92(6):692-697．

17 許玲芬，郭靜，滕旭，等．血小板活化因子引起腸上皮細(xì)胞屏障非凋亡依賴性的通透性增高［J］．中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40(3):220-223．

18 杜翠霞．血清降鈣素原和C反應(yīng)蛋白水平在感染性疾病中的診斷價(jià)值 ［J］．實(shí)用心腦肺血管病雜志，2012，20(8):1366．

19 張呈祥，侯明，鮑海詠．降鈣素原對(duì)急性胰腺炎的早期診斷價(jià)值分析［J］．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2012，15(4):1246．

20 商麗娜，李華，楊再剛，等．脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2與2型糖尿病大血管病變相關(guān)性研究［J］．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2012，15(4):1326-1328．

21 羅瓊，桂慶軍．脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系［J］．實(shí)用心腦肺血管病雜志，2012，20(3):512．

22 周小波，范學(xué)榮，郭宏偉，等．西洛他唑?qū)Ψ€(wěn)定型心絞痛患者脂聯(lián)素和內(nèi)皮素-1及一氧化氮的影響［J］．實(shí)用心腦肺血管病雜志，2013，21(4):48．

23 Luo Y，Cha DG，Liu YL，et al．Differential effects of selective and non-selective nitric oxide synthase inhibitors on the blood perfusion of ischemia-reperfused myocardium in dogs［J］．Med Sci Monit Basic Res，2013，19:181-186．

24 金呈強(qiáng)，董海新，劉仿．ITP小鼠模型中NO/NOS對(duì)ROS生成影響作用的研究 ［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013，17(3):417-420．

25 邢偉，賀曉燁，王建武，等．谷氨酰胺對(duì)急性肺損傷大鼠HGF及KGF的影響［J］．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23(10):28-31．

26 Kumarasamy KK，Toleman MA，Walsh TR，et al．Emergence of a new antibiotic resistancemechanism in India，Pakistan，and the UK:amolecular，biological，and epidemiological study ［J］ ．Lancet Infect Dis，2010，10(9):597-602．

27 王小榮，李琳琳，牛春雨，等．全身炎癥反應(yīng)綜合征防治研究進(jìn)展 ［J］．中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32(7):2899-2902．

28 Ha MK，Song YH，Jeong SJ，et al．Emodin inhibits proinflammatory responses and inactivates histone deacetylase 1 in hypoxic rheumatoid synoviocytes ［J］．Biol Pharm Bull，2011，34(9):1432-1437．

29 王玉，周冬枝，夏欣欣，等．大黃素對(duì)急性放射性腸炎腸黏膜屏障的保護(hù)作用 ［J］．西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，34(2):248-252．