骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和抗生素對(duì)乳腺炎模型大鼠血清中急性期蛋白水平的影響

王 波 張 彤

(東風(fēng)公司總醫(yī)院外科，湖北 十堰 442008)

乳腺炎是女性哺乳期常發(fā)的一種疾病，主要是由于乳腺排乳不暢導(dǎo)致乳汁淤積加上細(xì)菌感染所致〔1〕。其是一種典型的炎性變化〔2〕，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛。大腸桿菌是臨床最常見的乳腺炎菌株，發(fā)生乳腺炎時(shí)病原體與其產(chǎn)生的內(nèi)毒素(LPS)等能誘導(dǎo)乳腺局部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致體內(nèi)的腫瘤壞死因子(TNF-α)白細(xì)胞介素(IL)-6、C反應(yīng)蛋白(CRP)等炎性細(xì)胞因子增加。一方面這些細(xì)胞因子能夠趨化免疫細(xì)胞從而清除病原體；另一方面炎癥發(fā)展也會(huì)引起乳腺的微循環(huán)障礙，導(dǎo)致乳腺組織壞死、無乳、化膿，長(zhǎng)期還會(huì)導(dǎo)致纖維化進(jìn)而永久喪失泌乳功能〔3〕，因此采用適宜的方法控制乳腺炎患者體內(nèi)炎癥的發(fā)展對(duì)乳腺炎的治療作用重大。大量研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)除了保留一部分的多向分化能力以外，其還具有明顯的免疫調(diào)節(jié)功能〔4〕，能降低受損部位的炎癥反應(yīng)，對(duì)受損組織起到保護(hù)作用。本研究向乳腺炎模型的SD大鼠乳房基部注射一定量的BMSCs或抗生素，旨在研究其對(duì)乳腺炎大鼠血清中的炎性細(xì)胞因子水平，以期為乳腺炎的治療提供新的思路與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS)購(gòu)自SIGMA公司；L-DMEM、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；大鼠TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β、IL-8、CRP ELISA試劑盒購(gòu)自Bender公司。注射用氨芐西林鈉0.5 g購(gòu)自張家界市長(zhǎng)康制藥有限責(zé)任公司。

1.2分組及設(shè)計(jì) 體重約350 g SPF級(jí)待產(chǎn)大鼠80只購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。采用乳頭管灌注內(nèi)毒素的方法建立乳腺炎模型。灌注內(nèi)毒素后24 h定義為d0，分為正常對(duì)照組、對(duì)照組、抗生素組、BMSCs組。正常對(duì)照組5只，其余每組25只，分別于d1、d3、d5、d7各組分別采取斷尾法獲取血液，制備血清，置于-80℃冰箱保存待測(cè)。正常對(duì)照組不注射LPS于-d1直接取血清檢測(cè)，對(duì)照組、抗生素組、BMSCs組于產(chǎn)后72 h經(jīng)乳頭管注入50 μl，1 μg/μl LPS，24 h觀察乳腺感染情況，有明顯乳腺發(fā)紅、腫脹、局部溫度升高的納入實(shí)驗(yàn)〔5〕。治療方案均為往乳房基部注射，對(duì)照組注射生理鹽水，抗生素組注射抗生素50 μl(5 000 U/側(cè)，注射LPS后24 h與48 h注射2次)，BMSCs組注射BMSCs 50 μl(106個(gè)，注射內(nèi)毒素后24 h注射1次)

1.3BMSCs的制備與培養(yǎng) 頸椎脫臼處死大鼠，75%酒精浸泡消毒，無菌取雙側(cè)股骨和脛骨，于磷酸鹽緩沖液(PBS)中剪斷兩端骨骺，PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，直到骨髓腔清亮，用NH4Cl紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，收集骨髓細(xì)胞，移至培養(yǎng)瓶(含10%FBS的L-DMEM)中，輕輕搖勻，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后換新鮮培養(yǎng)基除去未貼壁的細(xì)胞，以后每隔3天換一次液，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到80%融合后，0.25%的胰蛋白酶消化，以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞留用。

1.4ELISA檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采納相關(guān)系數(shù)>0.99的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每組先等量混合5只小鼠血清后成為一個(gè)樣品，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，取各孔平均值，檢測(cè)過程無異常。

2 結(jié) 果

用ELISA方法檢查不同組在不同時(shí)間點(diǎn)的血清中急性時(shí)相反應(yīng)蛋白的濃度，發(fā)現(xiàn)注射內(nèi)毒素24 h后所有乳房腫脹、局部溫度升高的小鼠的TNF-α、IL-6、CRP、IL-1β、IL-8、CRP均明顯上升(均P<0.05)，對(duì)照組各炎性細(xì)胞因子在觀察期間均逐漸下降。使用抗生素與BMSCs后d1～d7 TNF-α、IL-8均比d0低且TNF-α還比同日對(duì)照組要低(均P<0.05)，使用BMSCs則使CRP持續(xù)低于對(duì)照組(P<0.05)，BMSCs組d5、d7的IL-6明顯高于同日對(duì)照組(P<0.05)。BMSCs組的IL-1β只有d7與同日對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，d1、d3、d5均低于對(duì)照組(均P<0.05)，與同日抗生素組對(duì)比，IL-8與CRP在d5、d7均比抗生素組要低(P<0.05)。見表1。

表1 處理后各組血清炎性細(xì)胞因子濃度

3 討 論

乳腺炎的致病菌以大腸桿菌最為常見，而LPS是其致病的主要物質(zhì)之一，其感染乳房后能引起乳房紅、腫、熱、痛。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)用乳腺炎動(dòng)物模型的主要方法是采用乳房?jī)?nèi)注射LPS〔5〕。乳腺炎的預(yù)后與轉(zhuǎn)歸與其炎癥發(fā)展進(jìn)程緊密相關(guān)，及早地清除病原體并去除局部炎癥環(huán)境是其治療的主要目的。為了研究乳腺炎發(fā)展過程中體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)展?fàn)顩r，本研究采用乳頭管灌注LPS的方法建立乳腺炎模型，模型小鼠均表現(xiàn)為乳房腫脹與局部發(fā)熱，且其血清中的炎性細(xì)胞因子濃度均上升，說明本實(shí)驗(yàn)成功建立了乳腺炎模型。

LPS誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)與細(xì)胞因子的含量升高關(guān)系密切，且炎性細(xì)胞因子還能繼發(fā)性的導(dǎo)致浸潤(rùn)到局部的炎癥細(xì)胞增多〔6〕，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞就是早期浸潤(rùn)的細(xì)胞，巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-8，又能使中性粒細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎癥因子及增強(qiáng)其脫顆粒能力，增加組織中的髓過氧化物酶(MPO)量，MPO使血管內(nèi)皮腫脹、血小板淤積導(dǎo)致乳腺內(nèi)微循環(huán)障礙，乳房腫脹疼痛〔7〕。BMSCs能表達(dá)Toll樣受體(TLR4)，能與LPS結(jié)合表現(xiàn)出與巨噬細(xì)胞、LPS結(jié)合不一樣的效應(yīng)，前者能促進(jìn)自身分化并阻止其余巨噬細(xì)胞的結(jié)合，或誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌抗炎性細(xì)胞因子，二者結(jié)合后主要起到識(shí)別病原體、激活自身已達(dá)到清除病原體的作用。這可能是BMSCs能降低乳腺炎炎癥反應(yīng)程度的機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠不采取治療方案的對(duì)照組各炎性細(xì)胞因子在觀察期間均表現(xiàn)為逐漸下降，這可能和其炎癥在逐漸自身消退有關(guān)，使用抗生素與BMSCs后TNF-α、IL-8明顯低于對(duì)照組。BMSCs還能使CRP持續(xù)低于對(duì)照組，這與BMSCs能保護(hù)受損組織，降低其局部炎癥反應(yīng)有關(guān)〔7～9〕。采取注射LPS方式模擬的乳腺炎組織中病原菌數(shù)量較少，而抗生素也能起到類似BMSCs降低炎癥反應(yīng)的作用，可能和抗生素其自身也能進(jìn)入炎癥細(xì)胞里且還能破壞炎癥細(xì)胞的吞噬功能相關(guān)〔10〕。IL-2的水平在各組區(qū)別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其可能是注射BMSCs的次數(shù)與數(shù)量較少所致，也可能是由于IL-2主要由激活的輔助T細(xì)胞產(chǎn)生，在觀察期內(nèi)，還沒有完全發(fā)揮作用。

乳腺是一個(gè)功能調(diào)控比較復(fù)雜的組織，受到眾多因子的影響，包括神經(jīng)遞質(zhì)、抗體、酶、細(xì)胞因子等。乳腺炎發(fā)生后，局部及全身過度表達(dá)的炎癥細(xì)胞因子會(huì)影響乳腺炎的預(yù)后，導(dǎo)致其功能發(fā)生紊亂。本研究為進(jìn)一步采取降低炎性反應(yīng)的方法治療乳腺炎提供了一些依據(jù)。

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