高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型的研究進(jìn)展

邵俊偉，蔡遜

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院普通外科，武漢 430070)

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病之一，目前全球約有1.5 億人患有糖尿病，其患病率逐年上升，其中90%以上是2 型糖尿病［1］。但發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。因此建立合適的2 型糖尿病動(dòng)物模型對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制，完善預(yù)防及治療方法具有重要意義。目前制備糖尿病大鼠模型的方法主要有自發(fā)性動(dòng)物模型［2］、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型［3］和實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型［4］。但是前兩者由于來源相對(duì)減少、飼養(yǎng)和繁殖條件要求嚴(yán)格、動(dòng)物價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，限制了其在科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用和普及。目前國(guó)內(nèi)外最常用的是實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型。國(guó)內(nèi)外研究［5-7］一致表明，制備2 型糖尿病大鼠模型可通過高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗后，再注射低劑量STZ 損傷胰島功能，引起血糖升高，可模擬2 型糖尿病的發(fā)病過程。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)對(duì)胰島β 細(xì)胞具有高度選擇性毒性作用，通過自由基損傷胰島β 細(xì)胞，使其發(fā)生功能障礙，胰島素合成減少，引發(fā)糖尿?。?，9］。本文就建立2 型糖尿病大鼠模型的主要影響因素STZ 的應(yīng)用、高脂高糖飲食及大鼠的選擇與飼養(yǎng)條件等做一綜述。

1 STZ 的應(yīng)用

1.1 STZ 的配制

STZ 的純品為結(jié)晶粉狀物，其溶劑制劑不穩(wěn)定，在pH 值為4.0 時(shí)穩(wěn)定性最大，當(dāng)pH 值高于或者低于3.5 ～4.5 時(shí)則STZ 迅速降解。胡凱等［10］發(fā)現(xiàn)1% STZ 用前以0.1 mol/L、pH4.2 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制。章成昌等［11］認(rèn)為1% STZ 溶于0.1 mol/L、pH4.22 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液較為合適。吳晏等［12］認(rèn)為1% STZ 用前以0.1 mol/L、pH4.4 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制。王海濤等［13］注射前將STZ 溶于pH4.5 的0.1 mol/L 的檸檬酸緩沖液中。宋立江等［14］發(fā)現(xiàn)pH4.5 檸檬酸緩沖液可以作為理想的溶劑。綜上所述，0.1 mol/L，pH4.2 ～4.5 檸檬酸緩沖液可以作為STZ 理想的溶劑。STZ 必須保存于－20℃冰箱，現(xiàn)配現(xiàn)用，配好的檸檬酸緩沖溶液和STZ 溶液應(yīng)避光冰浴，10 min 內(nèi)用完。

1.2 STZ 的注射劑量

研究表明，高脂高糖喂養(yǎng)2 周后，45 mg/kg STZ腹腔注射大鼠成模率高，安全性強(qiáng)，維持時(shí)間長(zhǎng)，是理想的2 型糖尿病造模濃度［15］。Zhou 等［16］發(fā)現(xiàn)高脂高糖喂養(yǎng)4 周后腹腔注射STZ 40 mg/kg，成模率72.2%。張玉領(lǐng)［17］發(fā)現(xiàn)高脂高糖喂養(yǎng)4 周后，待大鼠出現(xiàn)明顯的肥胖和胰島素抵抗，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，可成功制備2 型糖尿病大鼠模型。施紅等［18］發(fā)現(xiàn)高脂高糖6 周后加腹腔注射STZ 30 mg/kg 1 次，可成功制備空腹和隨機(jī)血糖均升高、糖耐量減低及高血脂的2 型糖尿病大鼠模型。成模率75%。何清華等［19］根據(jù)不同高脂喂養(yǎng)時(shí)間及STZ劑量設(shè)計(jì)3 種不同方法，發(fā)現(xiàn)4 周齡雄性SD 大鼠，高脂喂養(yǎng)8 周后腹腔注射STZ 30 mg/kg，成模率最高，模型穩(wěn)定，無動(dòng)物死亡，更適合于2 型糖尿病的相關(guān)研究。

研究表明，單純的高脂高糖飼料喂養(yǎng)可以使動(dòng)物血糖升高，但需要很長(zhǎng)時(shí)間，至少要6 個(gè)月至1年以上［20，21］。如果一次性大劑量注射STZ，則直接損傷胰島β 細(xì)胞，則更傾向于1 型糖尿病的表型特點(diǎn)，影響研究結(jié)果，而且死亡率增加［22，23］。高脂飲食誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，動(dòng)物肥胖和胰島素抵抗更加明顯，加重了胰島素分泌功能的負(fù)擔(dān)，所需STZ 劑量減少。小劑量注射STZ 可激活免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)胰島的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更接近于T2DM 的模型［24］。但是考慮到動(dòng)物的年齡以及造模后續(xù)的實(shí)驗(yàn)還需要一定的時(shí)間，因此，建議高脂高糖飼養(yǎng)時(shí)間4 周左右為宜。

1.3 STZ 的注射頻次

在以往的造模中，以一次性大劑量STZ 注射造模、多次小劑量STZ 注射造模、STZ 加高脂高糖飲食誘發(fā)2 型糖尿病模型的建立較為多見［25］。相比較而言，一次大劑量STZ 注射造模，成功率雖高，但死亡率亦高，且易形成1 型糖尿病，多次小劑量STZ 注射造模，死亡率較低，但成功率不高。針對(duì)STZ 加高脂高糖飲食誘發(fā)2 型糖尿病模型的建立，金磊等［26］采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 周，配合30 mg/kg STZ 腹腔注射2 次，制備2 型糖尿病模型。龐燕等［27］認(rèn)為:2 次給藥法較1 次給藥法成模率高。但是目前多數(shù)研究者［16-19］認(rèn)為高脂高糖喂養(yǎng)4 ～8 周后，一次性腹腔注射STZ 30 ～45 mg/kg，可成功制備2 型糖尿病大鼠模型。

1.4 STZ 的注射方式

大量文獻(xiàn)報(bào)道［18，28，29］注射STZ 前，對(duì)大鼠禁食不禁水12 h 以上，可提高成模率，注射STZ 后，應(yīng)觀察2 h 左右，給予充足飲水和食物。楊金晶等［29］認(rèn)為非空腹可能影響STZ 的吸收，并且腸道排泄增多。章成昌等［11］發(fā)現(xiàn)STZ 注射在腹腔的固定一側(cè)，可保證相同實(shí)驗(yàn)條件，成模后血糖數(shù)據(jù)均一穩(wěn)定。另外，在進(jìn)行腹腔注射時(shí)應(yīng)使用一次性注射器及針頭等無菌操作，以防感染。

目前誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型的注射方式主要有腹腔注射與尾靜脈注射兩種途徑。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要采用腹腔注射法。相較而言，尾靜脈注射技術(shù)難度大，操作誤差大。注射時(shí)要注意注射速度，以免過快而致心衰，還要避免劑量過大致大鼠藥物性中度而亡。腹腔注射法易于操作，方便快捷，注射時(shí)抓住大鼠頭朝下，腹腔朝上，使內(nèi)臟移向上腹，避免注射入其他臟器內(nèi)［28］。另外，還要注意注射部位的適當(dāng)選擇，避免藥物誤入皮下，降低成模率。

2 高脂高糖飲食

大量研究表明，高脂高糖飲食是2 型糖尿病及胰島素抵抗發(fā)生的重要因素［30，31］。STZ 注射和高脂高糖喂養(yǎng)是形成2 型糖尿病模型的重要條件。高脂高糖飲食導(dǎo)致體內(nèi)糖脂代謝紊亂，通過糖脂肪酸循環(huán)、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)途徑抑制糖儲(chǔ)存，降低胰島素敏感性，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。

高脂高糖飼料按成分重量百分比常用配方如下:(1)高脂飼料配方:1.5%膽固醇、0.4%膽酸鈉、0.02%甲巰咪唑、10%糖、10%豬油、78.08%的基礎(chǔ)飼料［32］。(2)高脂飼料組成的各成分質(zhì)量百分比:基礎(chǔ)飼料67.75%、豬油10%、蔗糖20%、膽固醇2.5%、膽鹽0.25%［33］。(3)高脂飼料配方為:10%豬油、10%蔗糖、2.5%膽固醇、0.4%膽酸鈉和77%基礎(chǔ)飼料，所有成分混勻后壓粒即得［34］。(4)高脂高糖飼料:動(dòng)物脂肪15%、蔗糖20%、膽固醇5%、普通飼料60%［35］。(5)飼料組成:20.0% 豬油、10.0%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規(guī)飼料［17］。(6)高糖高脂飼料由10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規(guī)飼料配制［36］。綜上所述，高脂高糖的配方可總結(jié)為:10%～20%豬油、10% ～20%蔗糖、1.5% ～5%膽固醇、0.4% ～1% 膽酸鹽、60% ～80% 普通飼料、5% ～10%其他。

3 大鼠的選擇

3.1 大鼠的品系、性別、周齡、體重的選擇

目前國(guó)內(nèi)STZ 誘導(dǎo)大鼠2 型糖尿病模型常用的大鼠品系是SD 大鼠或者Wistar 大鼠。農(nóng)慧等［37］用相同劑量的STZ 造模，Wistar 大鼠的死亡率可以達(dá)到50%以上。因?yàn)镾D 大鼠的抵抗力強(qiáng)于Wistar 大鼠。但是，章成昌等［11］選用Wistar 大鼠，因?yàn)閃istar 大鼠有SD 大鼠的優(yōu)良基因，且比SD 大鼠更溫順，有利于實(shí)驗(yàn)操作的進(jìn)行和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集。因此，選用合適的動(dòng)物品系可以提高成模率。

此外，STZ 誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型有性別差異。Morimoto 等［38］發(fā)現(xiàn)雄性大鼠制備模型的成模率明顯高于雌性大鼠。另外，選擇成年雄性，可避免因受孕而影響觀測(cè)數(shù)據(jù)。蔣升等［39］發(fā)現(xiàn)雄性大鼠腹腔注射STZ 后14 天血糖穩(wěn)定，而雌鼠4 周后血糖才穩(wěn)定，而且成年后雌激素對(duì)糖脂代謝會(huì)產(chǎn)生一定的影響。因此選擇雄鼠造模對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)干擾更少。

有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠對(duì)于STZ 的敏感性有年齡依賴性，成鼠或大體重鼠較幼鼠或小體重鼠更易成模型［40］。劉歐飛等［41］發(fā)現(xiàn)鼠齡大的大鼠體內(nèi)進(jìn)入藥物的總量比鼠齡小得多，且代謝活動(dòng)減慢，對(duì)STZ的滅活作用減弱，藥物對(duì)胰島β 細(xì)胞的破壞更為嚴(yán)重。因此成年大鼠可使模型更接近T2DM。但是蔣朝暉等［35］認(rèn)為采用幼鼠造模更占優(yōu)勢(shì)，能為肥胖兒童糖尿病研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

體重對(duì)成模率也有影響。章成昌等［11］認(rèn)為STZ 注射前體重在(240±5)g 范圍的大鼠STZ 注射后成模率高，成模后胰島素水平更接近于正常對(duì)照組胰島素水平。體重高于此范圍的樣本，成模率低，成模后胰島素水平偏低。張新蘭等［42］發(fā)現(xiàn)體重在220 ～260 g 大鼠成模率高且死亡率低。體重低于200 g 成模率高但死亡率也高;體重高于260 g 大鼠死亡率、成模率均較低。

3.2 大鼠采血方式

蔣朝暉等［35］摸索了一套大鼠取血方式:對(duì)于少量的用血(1 mL 以下)，可用針刺尾靜脈或斷尾取血，自體前后對(duì)照和長(zhǎng)期間斷取血，用血量大(1 mL以上)，但又不能危害大鼠生命時(shí)，可從尾動(dòng)脈用注射器取血，需大量用血(5 ～10 mL)且不需顧及大鼠生命時(shí)，可以摘除眼球取血。

4 結(jié)論

總之，建立重復(fù)性好、穩(wěn)定性好及生理指標(biāo)控制嚴(yán)格的2 型糖尿病大鼠模型是研究2 型糖尿病發(fā)病機(jī)制必不可少的工具。2 型糖尿病大鼠模型的成模率受各種因素的影響，這就要求我們科研工作者在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制各方面條件，重視實(shí)驗(yàn)中每一個(gè)步驟，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)。以保證大鼠模型的成功率，并降低大鼠的死亡率。

［1］Wild S，Roglic G，Green A，et al．Global prevalence of diabetes:estimates for the year 2000 and projections for 2030［J］．Diabetes Care，2004，27(5):1047 －1053．

［2］Goto Y，Kakizaki M，Masaki N．Production of spontaneous diabetic rats by repetition of selective breeding［J］．Tohoku J ExpMed．1976，119(1):85 －90．

［3］Srinivasan K，Ramarao P．Anamal models in type 2 diabetes research:an overview［J］．Indian J Med Res．2007，125(3):451－472．

［4］Al －Khalifa A，Mathew TC，Al-Zaid NS，et al．Low carbohydrate ketogenic diet prevents the induction of diabetes using streptozotocin in rats［J］．Exp Toxicol Pathol．2011，63(7 －8):663－669．

［5］Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus:Report of the expert committee on the diagnosis and classification of diabetes mellitus［J］．Diabetes Care，2003，26(suppl 1):5 －20．

［6］楊架林，李果，劉優(yōu)萍，等．長(zhǎng)期高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素建立人類普通2 型糖尿病大鼠模型的研究［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2003，11(3):138 －141．

［7］Chatzigeorgiou A，Halapas A，Kalafatakis K，et al．The use of animal models in the study of diabetes mellitus［J］．In Vivo，2009，23(2):245．

［8］Brever MD，Bottinger E，Brosius FC，et al．Mouse models of diabetic nephropathy［J］．J Am Soc Nephrol，2005，16(1):27．

［9］Elsner M，Guldbakke B，Tiedge M，et al．Relative importance of transport and alkylation for pancreatic beta-cell toxicity of streptozotocin［J］．Diabetologia，2000，43(12):1528．

［10］胡凱，阮利君，葛衛(wèi)紅．Ⅱ型糖尿病大鼠模型的尿液代謝組學(xué)研究［J］．浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，37(6):751 －760．

［11］章成昌，謝光榮，姜玉濤，等．鏈脲菌素制備2 型糖尿病大鼠模型的研究［J］．安徽醫(yī)藥，2012，16(9):1241 －1244．

［12］吳晏，韓靜，黃黎明，等．高脂喂養(yǎng)合并小劑量鏈脲佐菌素建立2 型糖尿病大鼠模型［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012，20(2)::11 －15．

［13］王海濤，楊明峰，孫保亮，等．糖尿病并腦梗死大鼠模型的建立體會(huì)［J］．中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2013，11(8):971 －972．

［14］宋立江，劉長(zhǎng)青，郭金銘，等．不同溶劑在鏈脲佐菌素血糖模型的作用比較［J］．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，35(17):3454 －3455．

［15］徐文平．不同濃度STZ 腹腔注射與2 型糖尿病大鼠模型建立［J］．中國(guó)民康醫(yī)學(xué)，2013，25(9):32 －33．

［16］Zhou YS，Gao Y，Guo XH，et al．Effect of timely insulin treatment on protection of β cells in a rat model of type 2 diabetes mellitus［J］．Chin Med J，2004，117(10):1523 －1529．

［17］張玉領(lǐng)，陳培，劉家秀，等．2 型糖尿病大鼠模型的建立［J］．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，39(15):3922 －3924．

［18］施紅，金國(guó)琴，余文珍．誘導(dǎo)構(gòu)建最佳類似人類2 型糖尿病大鼠的造模方式［J］．中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9(39):69 －71．

［19］何清華，周迎生，王征，等．2 型糖尿病大鼠模型制備的影響因素及其特點(diǎn)［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007，15(6):425－429．

［20］Winzell MS，Ahrén B，et al．The high-fat diet-fed mouse:a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes［J］．Diabetes，2004，53(suppl 3):215 －219．

［21］Chalkley SM，Hettiarachchi M，Chisholm DJ，et al．Long-term high fat feeding leads to severe insulin resistance but not diabetes in Wistar rats［J］．Am J Physiol Endocrinol Metab，2002，282(6):1231 －1238．

［22］董佳生，徐華，王露萍，等．SD 大鼠1 型糖尿病動(dòng)物模型的建立［J］．山西醫(yī)藥雜志，2009，38(3):218 －220．

［23］Wilkinson-Berka JL，Kelly DJ，Koerner SM，et al．ALT-946 and aminoguanidine，inhibitors of advanced glycation，improve severe nephropathy in the diabetic transgenic (mREN-2)27 rats［J］．Diabetes，2002，51(11):3283 －3289．

［24］孫兆峰，王利，夏作理．2 型糖尿病動(dòng)物模型研究概要［J］．中國(guó)微循環(huán)，2008，12(3):187 －189．

［25］周敏，柴可夫．實(shí)驗(yàn)性2 型糖尿病動(dòng)物模型研究及其進(jìn)展［J］．浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，25(5):79 －80．

［26］金磊，劉立杰，李慧．2 型糖尿病大鼠肝臟損傷與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白－1c、c-Jun 氨基末端激酶表達(dá)的關(guān)系［J］．中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10(5):19 －21．

［27］龐燕．大鼠糖尿病模型的建立［J］．四川解剖學(xué)雜志，2009，17(2):23 －25，30．

［28］胡玉煥，寧亞功，肖燕．高熱量飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型的影響因素［J］．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，25(1):70 －73．

［29］楊金晶，楊秋萍．鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型的體會(huì)［J］．昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008(2B):164 －166．

［30］Kim CH，Youn JH，Park JY，et al．Effects of high-fat diet and exercise training on intracellular glucose metabolism in rats［J］．Am J Physiol Endocrinol Metab，2000(6)，278:977 －984．

［31］Sumiyoshi M，Sakanaka M，Kimura Y．Chronic intake of high-fat and high-sucrose diets differentially affects glucose intolerance in mice［J］．J Nutr，2006，136(3):582 －587．

［32］靳瑾，孫侃，薛以貴，等．實(shí)驗(yàn)性糖尿病大血管病變SD 大鼠模型的建立［J］．石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，27(5):622 －625．

［33］范愛紅，李偉．Exendin－4 對(duì)2 型糖尿病大鼠胰島β 細(xì)胞增殖的影響［J］．中國(guó)老年學(xué)雜志，2009，29(24):3219 －3221．

［34］楊李，唐瑛，陳芳，等．芪蓮湯顆粒長(zhǎng)期干預(yù)對(duì)大鼠糖尿病并發(fā)癥的影響［J］．醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)2011，30(5):563 －565．

［35］蔣朝暉，呂玉晶，趙芳，等．高脂高糖飲食結(jié)合鏈脲佐菌素建立2 型糖尿病大鼠模型的改良［J］．中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，21(1):33 －35．

［36］汪園園，歐斌，李蘇華，等．利用高糖高脂飲食建立胰島素抵抗大鼠模型［J］．深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，21(1):13－14．

［37］農(nóng)慧，盛慶壽，梁健，等．STZ 誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的研究［J］．廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27(1):69 －72．

［38］Morimoto S，Mendoza-Rodriguez CA，Hiriart M，et al．Protective effect of testosterone on early apoptotic damage induced by streptozotocin rat pancreas［J］．J Endocrinol，2005，187(2):217－224．

［39］蔣升，謝自敬，張莉．鏈脲佐菌素誘導(dǎo)1 型糖尿病大鼠模型穩(wěn)定性觀察［J］．中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(1):16 －18．

［40］Masiello P，De Paoli A，Bergamini E．Age dependent changes in the sensitivity of the rat to a diabetogenic agent (streptozotocin)［J］．Endocrinology，1975，96(3):787 －789．

［41］劉歐飛，何依珊．動(dòng)物體重對(duì)四氧嘧啶致糖尿病模型效果的影響［J］．中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4(13):75 －76．

［42］張新蘭．體重因素對(duì)鏈脲佐菌素所致糖尿病大鼠模型的影響［J］．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10(5):179．