制備低劑量四氯化碳誘導(dǎo)小鼠慢性肝損傷模型的探討

李夢，翟亞南，王晶晶，孟霞，孫泉，陳柏安，盧靜

(首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，北京 100069)

建立人類疾病動物模型對于研究疾病的發(fā)生發(fā)展和發(fā)病機(jī)制非常重要。肝損傷動物模型的制備方法有很多，根據(jù)發(fā)病時程可分為急性、慢性和慢加急性肝損傷模型；根據(jù)模型制作方式可分為手術(shù)法、藥物法等。急性的、藥物法的肝損傷模型較多，然而急性肝病只占臨床病人的少部分，慢性病例占據(jù)大多數(shù)，而且慢性肝病初期不易察覺，難以診斷，因此肝病的慢性過程逐漸引起重視。藥物模型有很多，重復(fù)性和模擬性好的藥物毒性大，而其他的則建模結(jié)果不夠穩(wěn)定。并且，目前用大鼠制作肝損傷動物模型較多，而現(xiàn)在每年小鼠的使用量仍占實驗動物總量的一半以上，而且小鼠的基因組研究的最透，實驗相關(guān)的試劑和材料來源最廣，所以，使用低毒性的藥物建立和復(fù)制小鼠慢性肝損傷動物模型非常重要。本研究使用低濃度四氯化碳制備更加安全便捷的慢性肝損傷動物模型。本實驗使用0.5% CCl4給予小鼠連續(xù)腹腔注射6周(1次/3天)，發(fā)現(xiàn)血清ALT、AST濃度極顯著性增高(P<0.01)、肝上皮細(xì)胞呈廣泛性空泡樣變及大量壞死，肝小葉內(nèi)出現(xiàn)明顯的條索樣纖維增生，其纖維化程度評分顯著性升高(P<0.05)，纖維顯色積分光密度值極顯著性增高(P<0.01)。低劑量CCl4誘導(dǎo)后，小鼠呈現(xiàn)明顯肝損傷改變，現(xiàn)將本實驗結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級B/C雄性小鼠20只，體重18～20 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】。飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部【SYXK(京)2010-0020】，室溫20～25℃之間，空氣流通，相對濕度40%～70%，正常光照條件，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 實驗試劑

CCl4，溶液購自北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司。Masson染色試劑盒購自南京建成科技有限公司，20100318。

1.3 動物分組與模型制備

將B/C小鼠隨機(jī)分為正常對照組(6只)、油對照組(6只)、CCl4模型組(8只)。正常對照組給以正常飲食，飼養(yǎng)6周；油對照組腹腔注射法注射魯花花生油，10 μL/g，1次/3天，連續(xù)6周； CCl4模型組腹腔注射法注射0.5% CCl4注射液(0.75 mL CCl4原液加入149.25 mL花生油配成0.5%的慢性CCl4注射液)，10 μL/g，1次/3天，連續(xù)注射6周。

1.4 樣本處理

連續(xù)腹腔注射第6周，各組小鼠麻醉后(10%水合氯醛，0.35 mL/100 g)眼眶動靜脈采血法采血。采血時間為每日上午8:30-10:30，時間固定，離心取血清。采血后頸椎脫臼處死，取出肝臟，用濾紙吸干血跡，將最大葉1/3剪下，置于4%甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、透明、包埋后制成蠟塊并切片(0.5 μm)。

1.5 血清檢測

使用日立7180全自動血生化儀檢測血清AST、ALT劑量。

1.6 肝組織HE及Masson染色

使用Leica Autostainer XL自動染色儀水化并HE染色，使用Masson染色試劑盒行Masson染色，使用Nikon數(shù)字顯微照相機(jī)觀察并拍攝照片。。

1.7 肝纖維化程度評判

(1)采用盲評法，HE染色切片，40×10倍光鏡下，每組隨機(jī)選取5個視野。標(biāo)準(zhǔn)如下：“-”無成纖維細(xì)胞增生，計0分；“+”匯管區(qū)擴(kuò)大，有少量成纖維細(xì)胞增生，計1分；“++”匯管區(qū)成纖維細(xì)胞增生并向小葉內(nèi)延伸，呈較窄較短的纖維素條，計2分；“+++”匯管區(qū)成纖維細(xì)胞大量增生并向小葉內(nèi)明顯延伸，形成纖維隔伴有小葉結(jié)構(gòu)紊亂，計3分。

(2)Masson染色半定量分析，Masson染色切片，40×10倍光鏡下，每組隨機(jī)選取6個視野使用Nikon數(shù)字顯微照相機(jī)觀察并經(jīng)行積分光密度測量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理方法

數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差( mean ± SD) 表示，實驗結(jié)果用 SPSS 13.0 軟件進(jìn)行處理，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并作兩兩比較。取P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 血清ALT、AST變化

如表1示，第6周CCl4模型組B/C小鼠血清ALT濃度與正常對照組、油對照組比較極顯著性增高(P=0.00)；AST濃度與正常對照組、油對照組比較極顯著性增高(P=0.00)。

表1 第6周CCL4肝損傷B/C小鼠血清ALT、AST濃度組間比較±s)

2.2 病理學(xué)特征

小鼠肝組織HE、Masson染色結(jié)果(圖1、2，見彩插6)：HE染色可見，正常對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝竇清晰、較寬，肝上皮細(xì)胞排列整齊，呈多邊型，細(xì)胞質(zhì)均勻紅染，細(xì)胞核清晰，未見明顯腫脹變性，枯否氏細(xì)胞分布均勻，未見局部大量聚集；油對照組與正常對照組比較，小葉結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、分布未見明顯差異；10倍鏡下可見CCl4模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)異常紊亂，肝上皮細(xì)胞呈廣泛性空泡樣變，出現(xiàn)明顯的結(jié)節(jié)性增生和大量壞死點，40倍鏡下可見壞死的肝上皮細(xì)胞明顯空泡樣變，大量上皮細(xì)胞核濃縮、溶解、壞死，壞死細(xì)胞處出現(xiàn)枯否氏細(xì)胞聚集并相互融合形成多核巨細(xì)胞，對壞死細(xì)胞進(jìn)行吞噬，血竇在腫脹的上皮細(xì)胞相互擠壓下變細(xì)或消失。Masson染色可見，正常對照組肝組織10倍鏡下可見均勻的淡藍(lán)色細(xì)條索狀染色，40倍鏡下可見，藍(lán)染部位為肝上皮細(xì)胞間質(zhì)；油對照組與正常對照組比較，染色性狀與部位未見明顯改變；CCl4模型組肝組織出現(xiàn)大面積廣泛藍(lán)染，局部區(qū)域出現(xiàn)粗大條索樣藍(lán)色深染，特別是在肝上皮細(xì)胞大量變性壞死區(qū)域，藍(lán)色深染充斥整個區(qū)域，細(xì)碎偏淡的條狀藍(lán)染已經(jīng)融合成粗大、深藍(lán)的結(jié)節(jié)樣改變。

2.3 肝纖維化程度評價

6周時(見圖2)，CCl4模型組小鼠肝組織匯管區(qū)成纖維細(xì)胞大量增生并向小葉內(nèi)明顯延伸，形成纖維隔伴有小葉結(jié)構(gòu)紊亂。經(jīng)盲評法評判肝纖維化程度(見圖3-a)，CCl4模型組小鼠與油對照組小鼠比較，其肝組織纖維化程度評分顯著性升高(P=0.00)；經(jīng)Masson染色后積分光密度值比較(見圖3-b)，CCl4模型組小鼠與油對照組小鼠比較，其積分光密度極顯著性增高(P=0.00)。

圖3 肝組織纖維化程度評分結(jié)果(a)和肝纖維化吸光度結(jié)果(b)

3 討論

CCl4進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450激活，生成CCL3·。CCL3·生成后，能夠與細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸反應(yīng)生成脂肪酸原子團(tuán)，從而引起脂質(zhì)過氧化而導(dǎo)致細(xì)胞膜、細(xì)胞器損傷。CCl4致肝損傷主要表現(xiàn)為血清中AST、ALT含量增加和肝上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化或壞死，在病理上主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞腫脹、脂肪變性，繼而破裂壞死，大量枯否氏細(xì)胞聚集吞噬，隨著損傷程度加深，肝細(xì)胞增殖減弱，膠原纖維大量堆積，形成條索狀增生。

本實驗結(jié)果顯示：第6周時，HE染色后，10倍鏡下可見CCl4模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)明顯的結(jié)節(jié)性增生和大量壞死點，40倍鏡下可見壞死的肝上皮細(xì)胞腫脹，大量上皮細(xì)胞核濃縮、溶解、壞死，壞死細(xì)胞處出現(xiàn)枯否氏細(xì)胞聚集并相互融合形成多核巨細(xì)胞，對壞死細(xì)胞進(jìn)行吞噬，血竇在腫脹的上皮細(xì)胞相互擠壓下變細(xì)或消失。而在相同部位Masson染色可見，CCl4模型組肝組織出現(xiàn)大量結(jié)節(jié)樣藍(lán)色深染，特別是在肝上皮細(xì)胞大量變性壞死區(qū)域，藍(lán)色深染充斥整個區(qū)域，細(xì)碎偏淡的條狀藍(lán)染已經(jīng)融合成粗大、深藍(lán)的結(jié)節(jié)樣改變(見圖1、2)。同時，CCl4模型組連續(xù)腹腔注射6周時，與正常對照組比較其血清ALT、AST濃度均大幅升高。AST升高10倍以上，而ALT升高100倍以上，提示在6周時，CCl4模型組小鼠出現(xiàn)了明顯的肝損傷(見表1)。

有關(guān)肝損傷模型的研究結(jié)果不盡相同，原因在于肝損傷過程中藥物濃度與給藥時間對模型成功與否影響重大。較強(qiáng)的藥物刺激能夠迅速導(dǎo)致肝損傷發(fā)生，但其死亡率偏高。而較低的藥物刺激能夠較好的保障模型動物的存活率，但其造模時間較長[4]。因而，如何能在較低強(qiáng)度藥物刺激下，縮短成模時間，既提高實驗動物存活率，降低實驗動物使用量，又能縮短成模時間，減輕實驗動物痛苦與科研物力財力消耗，是目前肝損傷模型研究的現(xiàn)實意義所在，亦是動物福利3R原則的體現(xiàn)。根據(jù)張海燕實驗提示：①當(dāng)四氯化碳溶液的濃度超過50%或給予劑量大于2.5 mL/(kg·bw)以上時，肝損傷明顯但易導(dǎo)致動物急性中毒而死亡。②給藥間隔時間，1～2d注射一次容易導(dǎo)致動物中毒死亡，而給藥間隔超過4～5d 時動物肝臟損傷不明顯。原因在于肝臟再生能力強(qiáng)，給藥間隔較長時肝臟能夠通過肝細(xì)胞再生等修復(fù)機(jī)制迅速恢復(fù)肝功能。因此，為了能在有效維持四氯化碳致肝損傷效果的基礎(chǔ)上降低死亡率，應(yīng)采用小劑量四氯化碳注射且給藥間隔時間為3d的造模方法。其實驗結(jié)果顯示，每3d注射一次20%四氯化碳持續(xù)8周后，大鼠血清ALT和AST水平顯著升高，肝細(xì)胞出現(xiàn)典型的胞質(zhì)疏松化、氣球樣變，可見散在的點狀、碎片狀壞死及炎性細(xì)胞浸潤，還伴有明顯的纖維化改變[5]，肝損傷明顯?；谝陨蠈嶒炈悸放c報道，我們將該方法移用在B/C雄性小鼠身上，并選用更低劑量CCl4(0.5%)1次/3天連續(xù)注射6周，觀察其肝損傷情況。結(jié)果在第6周發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較模型小鼠血清ALT、AST濃度均極顯著性升高，HE、Masson染色顯示大量肝細(xì)胞脂肪變性、壞死及條索樣膠原纖維形成(見表1，圖1、圖2)。對于膠原纖維增生的評價，我們采用了人工盲評和積分光密度統(tǒng)計兩種方法，兩種方法均顯示CCl4模型組小鼠與油對照組小鼠比較，其膠原纖維增生顯著性升高(見圖3)。由此可見，對于B/C雄性小鼠而言，每3天注射一次0.5% CCl4的低強(qiáng)度藥物刺激方式，在6周時可以出現(xiàn)明顯的肝損傷及纖維樣變。

本實驗通過分析肝臟病理形態(tài)結(jié)構(gòu)和血清生化指標(biāo)對低劑量CCl4誘導(dǎo)B/C小鼠肝損傷模型進(jìn)行評價，結(jié)果顯示：低濃度四氯化碳通過腹腔注射法可以復(fù)制小鼠肝損傷動物模型，降低了四氯化碳的毒副作用，具有推廣意義和應(yīng)用價值。

(本文圖1、2見彩插6。)

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