獸藥殘留檢測技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展方向

黃雪英，沈 丹

(廣州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣州510440)

獸藥是現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的物質(zhì)基礎(chǔ)，在生產(chǎn)實踐中，卻經(jīng)常被誤用或濫用而造成畜禽產(chǎn)品獸藥殘留超標(biāo)。從1999年開始，農(nóng)業(yè)部開始在全國范圍組織實施國家獸藥殘留監(jiān)控計劃，主要監(jiān)測我國禁用獸藥和常用獸藥，經(jīng)過十幾年的努力，總體呈好轉(zhuǎn)趨勢［1］。但近幾年的監(jiān)控結(jié)果顯示，在畜禽產(chǎn)品中仍然有磺胺類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類等獸藥殘留超標(biāo)現(xiàn)象，甚至有的樣品中還檢出了違禁物質(zhì)如氯霉素和硝基呋喃代謝物。殘留的獸藥會影響動物產(chǎn)品品質(zhì)，危害消費者身體健康，對人造成中毒反應(yīng)、過敏反應(yīng)，甚至引起“三致作用”［2］。獸藥殘留檢測作為控制藥物殘留的重要手段和方法，已成為畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全的有力保證。針對獸藥殘留的檢測，國內(nèi)外通用的做法是先用“快速篩查方法”初篩檢測，再用“確證檢測方法”確證檢測［3］。初篩方法要求容易使用、高流通量、運行成本低、能夠快速獲得結(jié)果。確證方法則要求靈敏度高、定性無差錯、定量準(zhǔn)確。本文對主要的獸藥殘留檢測技術(shù)及其應(yīng)用現(xiàn)狀進行了介紹，并對獸藥殘留檢測技術(shù)在未來的發(fā)展方向進行了展望，以期為研究更高效的檢測方法提供參考。

1 快速篩查方法

目前針對畜禽產(chǎn)品獸藥殘留的“快速篩查方法”主要有酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法、生物傳感器、高效液相色譜法和高效薄層色譜法等。

1.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)ELISA是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)，一般將抗原或抗體吸附于固相載體進行免疫酶反應(yīng)，經(jīng)底物顯色后用酶標(biāo)儀進行檢測。ELISA方法操作簡單、靈敏度和特異性高，可同時進行大批量樣品檢測，已廣泛用作獸藥殘留檢測的快速篩選方法。Jiang等［4］用ELISA方法檢測豬肉、雞肉等動物組織中呋喃妥因代謝物，在 0.2 ～5 μg/kg水平上的回收率為75% ～116.7%。用ELISA測定動物組織中的慶大霉素殘留，在8、20和50 mg/kg水平上的回收率為69% ～118%［5］。張澤英［6］列出了近 3 年(2010 至2013年)國內(nèi)外有關(guān)抗微生物類獸藥殘留ELISA檢測方法的應(yīng)用情況，檢測藥物包括氨基糖苷類、磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、β－內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等獸藥。徐偉等［7］綜述了ELISA檢測在動物產(chǎn)品中的應(yīng)用，對呋喃它酮代謝物、四環(huán)素類、磺胺類、苯巴比妥、己烯雌酚、氯霉素、黃曲霉素等藥物進行檢測，發(fā)現(xiàn)這些檢測都表現(xiàn)出了高的靈敏度和準(zhǔn)確度?？梢娔壳皫缀跛谐Ｒ姷墨F藥殘留都已經(jīng)建立了ELISA檢測方法，ELISA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類獸藥殘留的快速檢測。

1.2 膠體金免疫層析法(GICA)GICA是以膠體金為標(biāo)記物的免疫層析方法，它多以條狀纖維層析材料(通稱試紙條)為固相載體，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上橫向流動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)結(jié)合，再通過膠體金結(jié)合物達到檢測目的。該方法操作簡單、可現(xiàn)場檢測、成本低、不需儀器、幾分鐘即可出結(jié)果。Jiang等［8］用該方法檢測了豬肉和牛肉中的19－去甲睪酮殘留，檢測限可達2 μg/kg。萬宇平等［9］研制了一種快速檢測牛奶中的氟喹諾酮類藥物試紙卡，并配合膠體金試紙卡讀數(shù)儀使用，可以檢測恩諾沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星等十余種氟喹諾酮藥物，檢測限為20～40 μg/L。薛曉等［10］介紹了GICA在畜禽產(chǎn)品獸藥殘留檢測中的研究應(yīng)用，包括抗生素類、磺胺類，呋喃類、β－興奮劑等藥物殘留檢測。目前已有市售的氯霉素、克倫特羅、萊克多巴胺等多種試紙條經(jīng)農(nóng)業(yè)部備案，用GICA測定孔雀石綠、三聚氰胺、慶大霉素等也都已見報道。

1.3 生物傳感器 生物傳感器的構(gòu)成包括生物敏感部件和換能器，樣品中被分析物與生物敏感部件作用，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的生物化學(xué)信號被相應(yīng)的換能器轉(zhuǎn)變?yōu)榭啥刻幚淼碾娦盘枺M一步用適當(dāng)?shù)膬x器分析，便可測得被分析物的結(jié)果。獸藥殘留檢測通常采用基于表面等離子體共振技術(shù)的生物傳感器進行檢測，劉瑾等［11］采用表面等離子共振生物傳感器檢測牛奶中的氨芐青霉素殘留，對牛奶溶液檢測最低檢測限為1.8 ng/mL。生物傳感器在抗生素、β－受體激動劑和抗寄生蟲藥物等獸藥殘留檢測應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)展迅速［12］。白冰等［13］介紹了生物傳感器在四環(huán)素、土霉素、對苯二酚和鹽酸克倫特羅等殘留檢測方面的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，生物傳感器具有選擇性好、靈敏度高、響應(yīng)快、易于操作、高通量及適合現(xiàn)場檢測等優(yōu)點［14］，已成功應(yīng)用于對肉類食品中的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、鏈霉素、氯霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、伊維菌素、西瑪三嗪、青霉素G、頭孢菌素、孕酮、泰樂菌素等藥物的檢測［15］。

1.4 高效液相色譜法(HPLC)HPLC由高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器等部件構(gòu)成，溶于流動相的各組分經(jīng)高壓輸液泵泵入系統(tǒng)，經(jīng)過色譜柱時，各組分由于與固定相發(fā)生作用的大小強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而達到分離檢測的目的。各種性能的色譜柱、不同種類的檢測器和自動化的可行性(進樣、洗脫、檢測等)在某種程度上促進了HPLC作為快速篩查技術(shù)的使用，它分離效能高、方法穩(wěn)定、精確度高，是目前大多數(shù)獸藥殘留的常規(guī)分析方法。Milagro等［16］介紹了HPLC用于快速篩查檢測肉品中生長促進劑殘留量的應(yīng)用。我國已經(jīng)出臺了一系列的應(yīng)用HPLC檢測獸藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法，可用于檢測四環(huán)素類、β－內(nèi)酰胺類、硝基咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、激素類等幾乎所有常見的獸藥殘留的檢測。近年來，超高效液相色譜的應(yīng)用也日益廣泛，超高效液相色譜比液相色譜具有更高的分離度、分析速度和靈敏度，周春鳳等［17］介紹了超高效液相色譜技術(shù)在獸藥分析領(lǐng)域應(yīng)用中的研究。

1.5 高效薄層色譜法(HPTLC) 薄層色譜(TLC)和柱色譜在分離原理上基本相同，將樣品點在以多孔吸附劑為載體的固定相上，流動相利用毛細管作用將樣品中不同組分推移到不同距離處而分離，色譜可用肉眼或使用光密度計和照相機記錄或用影像系統(tǒng)方法來評價。TLC簡便快速、可同時測定多個樣品，但重現(xiàn)性不好，靈敏度和分辨率遠遠不及HPLC。HPTLC改進了點樣技術(shù)、板技術(shù)，提高了檢測靈敏度，保持了TLC的優(yōu)點，可以同時檢測多個樣品，分析時間短。劉雪紅等［18］建立了雞肉中磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹惡啉多殘留檢測的薄層色譜法，三種藥物分離良好，斑點顯色清晰且無干擾，回收率約為60%，檢測限為0.05 μg/mL。現(xiàn)代的HPTLC實現(xiàn)了高水平的自動化，可以同時定量檢測肉品中的多殘留，但是由于其他檢測技術(shù)(如HPLC)使用范圍的擴大，在化學(xué)藥物檢測方面，它的使用迅速減少［19］。由于固定相(吸附劑)相對價廉，即用即棄，不必擔(dān)心樣品污染，檢測不受溶劑干擾，色譜直觀性強，在中獸藥快速篩查檢測方面被廣泛使用［20］。

其他快速檢測技術(shù)還有微生物抑制測定法、量子點標(biāo)記熒光檢測法、熒光偏振免疫檢測法、化學(xué)發(fā)光免疫檢測法、電化學(xué)免疫分析法等，這些快速檢測技術(shù)也可以滿足對大量樣品檢測、縮短檢測周期、降低檢測費用的需求，也是未來的發(fā)展趨勢［21］。

2 確證檢測方法

確證檢測方法多是應(yīng)用色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，將色譜的高效分離能力和質(zhì)譜強大的定性能力相結(jié)合，成為目前獸藥殘留分析領(lǐng)域中最強大、最有力的定性定量工具，主要應(yīng)用有氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS)和液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(LC－MS)。此外高效毛細管電泳和質(zhì)譜聯(lián)用(CE－MS)，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，也可用于確證檢測。

2.1 氣相色譜－質(zhì)譜法(GC－MS)GC－MS分析中樣品經(jīng)GC進樣，高溫瞬間汽化后，經(jīng)色譜柱分離，進MS檢測器測定，常用于復(fù)雜樣品的痕量分析。GC－MS具有分析速度快、分離效率高、靈敏度高、穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點。田苗［22］建立了豬組織中10種β－興奮劑類獸藥殘留量的檢測方法，檢出限、回收率和精密度等技術(shù)指標(biāo)均能滿足要求。王麗娜等［23］建立測定豬肉中己烯雌酚、雌二醇、炔雌醇、戊酸雌二醇殘留量的GC－MS法，平均回收率為78.3% ～82.5%(RSD為4.4% ～9.6%)。GC－MS適用于分析易揮發(fā)的小分子有機物，不適合分析沸點高、極性大、熱不穩(wěn)定的化合物。由于大多數(shù)獸藥是極性和沸點較高的化合物，因此用GC－MS進行獸藥殘留檢測前通常需衍生化處理，步驟較繁瑣，這使GC－MS在獸藥分析中的應(yīng)用受到一定限制。

2.2 液相色譜－質(zhì)譜法(LC－MS)LC－MS以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)，適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的獸藥殘留分析，也是目前獸藥殘留檢測中最強有力的工具。李丹等［24］建立了豬尿中西馬特羅、特步他林等20種β－受體激動劑殘留檢測的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測限均可低至0.25 μg/L，回收率為75.7% ～110.7%。FU 等［25］總結(jié)了用液相色譜 －串聯(lián)質(zhì)譜在檢測飼料、動物產(chǎn)品及尿液中獸藥的應(yīng)用狀況。王俊菊等［26］綜述了近年來高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在抗生素、抗球蟲和激素類藥物殘留分析中的應(yīng)用進展。目前LC－MS已被報道應(yīng)用在磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、阿維菌素類、β－內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氯霉素類、喹諾酮類、硝基呋喃類、激素類、β－受體激動劑、苯并咪唑類、三嗪類等幾乎所有種類的獸藥殘留分析中［27］。

LC－MS不僅用于檢測同類獸藥多組分殘留，還用于測定不同種類獸藥多組分殘留［28－31］，這也是近年來的研究方向和熱點，目前應(yīng)用研究已經(jīng)取得一定進展。郭德華等［32］建立了同時測定動物源性食品中76種獸藥殘留的檢測方法，Zhan等［33］定量分析了不同類別226種獸藥和其他污染物在豬和牛肌肉中的殘留量。但還存在不少問題，如前處理方法復(fù)雜，有待優(yōu)化，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度、精密度不夠好，有待提高等。

2.3 毛細管電泳－質(zhì)譜法(CE－MS) 以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，不同組分在高壓電場的作用下遷移速率不同，從而實現(xiàn)各組分分離，再經(jīng)質(zhì)譜檢測。毛細管電泳樣品用量少、分離效果好、分析速度快;和質(zhì)譜聯(lián)用，方法靈敏度高、特異性強，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留的確證性檢測。顏流水等［34］用毛細管電泳－質(zhì)譜聯(lián)用分離分析豬肝中的克倫特羅和沙丁胺醇，電泳分離時間小于6 min，檢出限分別為0.4 和0.3 μg/kg。Blasco 等［35］應(yīng)用 CE－MS/MS 檢測技術(shù)測定牛奶樣品中2種喹諾酮類和6種磺胺類獸藥多殘留，回收率均在78%以上，RSD%小于15%。付石軍等［36］綜述了毛細管電泳技術(shù)在畜產(chǎn)品中抗生素、抗菌藥物、激素及違禁藥物等殘留檢測的應(yīng)用現(xiàn)狀。

3 展望

隨著獸藥殘留檢測技術(shù)的不斷更新和完善，檢測方法也不斷向著快速、準(zhǔn)確、高效的方向發(fā)展。為了便于基層開展工作，開發(fā)便攜簡單的快速檢測產(chǎn)品，進一步提高檢測靈敏度和檢測范圍，同時實現(xiàn)多種成分的檢測，建立快速準(zhǔn)確、高通量、現(xiàn)場篩查的方法，應(yīng)是今后“快速篩查方法”發(fā)展的趨勢。而對于“確證檢測方法”，簡化復(fù)雜樣品前處理步驟，建立通用性的樣品制備方法，提高樣品制備自動化程度，增加樣品通量，提高檢測靈敏度，將是今后的發(fā)展方向。隨著各種檢測方法的發(fā)展融合，將來的檢測方法可以既是快速篩查方法，同時也是確證方法，如在線固相萃取(SPE)與色譜質(zhì)譜聯(lián)用，可以同時對樣品進行確認篩選，雖然儀器成本很高，但是當(dāng)進行大量樣品分析時，檢測效率將高過快篩與確證方法的結(jié)合使用，從而可以降低成本，更加具有競爭力。

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