魏氏梭菌α毒素分子生物學(xué)研究進(jìn)展

宮語晨，許崇利，錢愛東*，許崇波

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118;2.吉林化工學(xué)院化工與生物技術(shù)學(xué)院，吉林吉林132022;3.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連1166222)

魏氏梭菌是一種革蘭陽性厭氧桿菌，根據(jù)其產(chǎn)生的4種主要毒素α毒素(CPA)、β毒素(CPB)、ε毒素(ETX)和 ι毒素(ITX)，將其分為 A、B、C、D 和E 5種毒素型。然而這種細(xì)菌在不同毒素型中可以產(chǎn)生至少16種毒素，如魏氏梭菌θ毒素(又稱裂解素 O，PFO)、腸毒素(CPE)和β2毒素(CPB2)等致命毒素。多數(shù)情況下，魏氏梭菌引起的疾病是由一種或多種魏氏梭菌致病毒素所致［1－2］。各型魏氏梭菌均產(chǎn)生α毒素，它是魏氏梭菌最重要的致病毒素之一，而且也是A型魏氏梭菌最主要的毒力因子［3－4］。為此本文對α毒素的生物學(xué)特性及作用機(jī)制等方面進(jìn)行了綜述，以便為其相關(guān)研究提供參考。

1 α毒素的生物學(xué)特性

魏氏梭菌廣泛分布于土壤、水、食物、人畜腸道中，侵入患者傷口后，由于受損部位缺血造成缺氧，組織氧化電勢(Eh)下降，使其得以生長繁殖;同時往往與需氧菌混合感染，消耗組織內(nèi)氧氣，使Eh進(jìn)一步降低，而細(xì)菌本身分解糖類產(chǎn)生的大量氣體壓迫血管，更加重組織的缺血缺氧，諸多因素均造成組織內(nèi)低Eh環(huán)境，更利于該菌的生長繁殖，產(chǎn)生大量的α毒素［5－6］。α毒素具有細(xì)胞毒性、溶血活性、致死性、皮膚壞死性、血小板聚集和增加血管滲透性等特性［7－8］。α 毒素分子量約為43 kDa，通過比對 α毒素基因和磷脂酶 C(Phospholipase C，PLC)基因的核苷酸序列，結(jié)果表明α毒素與這種酶N端大約250個殘基有很強(qiáng)的同源性［9－10］。此外α毒素的C末端還有一個120個殘基的額外結(jié)構(gòu)域。這些發(fā)現(xiàn)說明α毒素屬于PLC家族［11－12］。由于α毒素能水解卵磷脂的C鏈，產(chǎn)生磷酰膽堿和甘油二脂，故又稱為PLC。對α毒素進(jìn)行的晶體分析顯示，它的結(jié)構(gòu)可以分成兩個區(qū)域:N端區(qū)域，有9個緊緊壓縮的α螺旋;C端結(jié)構(gòu)域包含8個反平行的β折疊層。N端含有3個包含鋅離子的活性位點。而且含有鋅離子的氨基酸殘基對酶的活性十分重要。混合α毒素C端和N端可恢復(fù)其溶血活性，表明C端影響著N端的活性［13］。研究表明，C端結(jié)構(gòu)域的折疊與突觸結(jié)合蛋白等真核磷脂結(jié)合蛋白的“C2”結(jié)構(gòu)域及其類似結(jié)構(gòu)相似。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用的真核蛋白也包含類似結(jié)構(gòu)域;269位和336位的天冬氨酸與鈣離子的特異性相互作用有關(guān)［14－15］。此外，275位、307 位和 331位的酪氨酸對α毒素的結(jié)合起關(guān)鍵作用。C端結(jié)構(gòu)域可能在與細(xì)胞膜的結(jié)合中扮演重要角色［16］。

α毒素可裂解由磷脂酰膽堿(PC)或鞘磷脂(SM)組成的脂質(zhì)體，從而使羧基熒光素(CF)和磷酸膽堿釋放出來。隨著脂質(zhì)體相變溫度的升高，羧基熒光素(CF)釋放減少，這表明，脂質(zhì)體對α毒素的敏感性與相變溫度有很大的關(guān)系［17］。而且α毒素結(jié)合脂質(zhì)體和α毒素導(dǎo)致的脂質(zhì)體中的磷脂酰膽堿(PC)的水解都與脂質(zhì)體中磷脂酰膽堿(PC)的相變溫度有關(guān)。由此可見，α毒素對膜的裂解作用同脂質(zhì)體的流動性息息相關(guān)。6－丙烯酰－2－二甲基氨基萘標(biāo)記的C端結(jié)構(gòu)域與脂質(zhì)體結(jié)合并出現(xiàn)顯著的藍(lán)色偏移。這表明C端結(jié)構(gòu)域插入到脂質(zhì)體中的疏水區(qū)，也說明α毒素對生物膜的破壞作用依賴于膜的流動性，而且這種破壞作用依賴于C端結(jié)構(gòu)域插入到膜脂雙分子層中。

2 α毒素基因的克隆和分析

α毒素的編碼基因位于染色體上的復(fù)制起始區(qū)并且毗連rrnA基因。該區(qū)域是細(xì)菌染色體上最穩(wěn)定的區(qū)域之一。α毒素基因首次從產(chǎn)生高水平α毒素的A型魏氏梭菌中被克隆并測定了其核苷酸序列［18－19］。α毒素基因已經(jīng)在大腸桿菌中實現(xiàn)了高效表達(dá)，在卵黃瓊脂培養(yǎng)基上其菌落周圍產(chǎn)生了渾濁區(qū)域，而在含有紅細(xì)胞的瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生了溶血效應(yīng)。核苷酸測序表明其含有一個包括原核信號序列的開放閱讀框。大腸桿菌中表達(dá)的α毒素蓄積在周質(zhì)空間也表明這一信號序列的存在。另外在魏氏梭菌的培養(yǎng)上清液中純化出了α毒素蛋白進(jìn)一步證實了上述觀點［20］。隨后從魏氏梭菌其他菌株里也克隆出α毒素基因并揭示了其生物學(xué)特征。這些α毒素基因都位于染色體上的復(fù)制起始區(qū)，并且平均有1.3%的核苷酸序列不同。

3 α毒素對細(xì)胞和生物膜的作用

高濃度的α毒素可大量水解生物膜上磷脂酰膽堿和鞘磷脂。然而，低濃度的α毒素只能少量水解磷脂酰膽堿和鞘磷脂并且產(chǎn)生二酰甘油和神經(jīng)酰胺。這些反應(yīng)會激活多種信號傳遞途徑。從而產(chǎn)生多種胞間介質(zhì)。α毒素也可激活生物膜上的磷脂代謝導(dǎo)致鼠腸和動脈組織的痙攣［21－22］。而且α毒素還可激活小鼠主動脈中花生四烯酸的級聯(lián)反應(yīng)［23］。研究表明α毒素引起的痙攣與花生四烯酸變成血栓素A2有很大關(guān)系。最近又有報道稱，其他微生物產(chǎn)生磷脂酶 C也有類似現(xiàn)象［24］。因此，很可能細(xì)菌中的磷脂酶C模擬真核生物細(xì)胞膜中磷脂酶C的作用。

α毒素可誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞胞間介質(zhì)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM－1)、白介素 －8(IL－8)，腫瘤壞死因子－α(TNF－α)，血小板活化因子(PAF)和內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附因子(LECAM)［25］。這些胞間因子的產(chǎn)生進(jìn)一步增加了血管的滲透性和水腫［26］。α毒素使血小板纖維蛋白原受體發(fā)生了易位，使其從血小板內(nèi)部轉(zhuǎn)到外膜，同時使血小板發(fā)生了凝集［27－28］。此外，在 α 毒素、腫瘤壞死因子－α(TNF－α)和干擾素－γ(IFN－γ)分別作用下，細(xì)胞發(fā)生了相類似的形態(tài)學(xué)改變［25］。

4 α毒素的表達(dá)調(diào)控

早期從氣性壞疽病人體內(nèi)分離到的魏氏梭菌產(chǎn)生的α毒素水平比較低，所以并不能闡明α毒素在疾病中扮演的角色。α毒素表達(dá)差異主要是由于α毒素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［29－30］。雖然α毒素在體內(nèi)的表達(dá)可能是被正調(diào)控的，但是有必要揭示出α毒素基因的調(diào)控機(jī)制。指導(dǎo)α毒素基因轉(zhuǎn)錄的啟動子包括－10和－35保守區(qū)，位于SD序列的上游。雖然α毒素基因的調(diào)控位點還沒有被鑒定出來，但是位于－35保守區(qū)上游的多個重復(fù)A堿基對于α毒素基因表達(dá)起著關(guān)鍵作［31－32］。和其他致病菌一樣，魏氏梭菌通過VirR/VirS雙組分調(diào)控系統(tǒng)來調(diào)控基因的表達(dá)［33－34］。VirS作為組氨酸激酶傳感器，對環(huán)境信號做出應(yīng)答，從而磷酸化VirR，磷酸化的VirR調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。對于調(diào)控VirR/VirS功能環(huán)境因素的鑒別不但能使我們充分理解細(xì)菌在傷口中上調(diào)α毒素的水平，而且也能更好地解釋在健康人腸道中α毒素表達(dá)被下調(diào)，而在某些疾病條件下被上調(diào)的原因。

5 α毒素與疾病

魏氏梭菌是人和動物多種疾病主要的致病因子。A型魏氏梭菌可引起傷口氣性壞疽。氣性壞疽是一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷感染性疾病，多見于軟組織嚴(yán)重開放性損傷。另外少數(shù)腸道手術(shù)后由于腸內(nèi)容物的污染也可以引起氣性壞疽［35］。但并不是所有傷口感染了魏氏梭菌都會引起氣性壞疽。氣性壞疽病的發(fā)生，并不單純地取決于魏氏梭菌的存在，更決定于人體抵抗力和傷口的情況，即需要一個有利于魏氏梭菌生長繁殖的缺氧環(huán)境。因此，失水、失血或休克，而又有傷口的大片組織壞死、深層肌肉損毀，容易發(fā)生氣性壞疽病。

實驗證明氣性壞疽主要是由魏氏梭菌產(chǎn)生的α毒素引起的。首先滅活α毒素基因的魏氏梭菌突變株在氣性壞疽的鼠模型中大大減少。其次用α類毒素免疫的小鼠可以有效抵抗氣性壞疽病。α毒素感染創(chuàng)傷面以后，破壞局部組織和炎癥細(xì)胞;當(dāng)毒素浸潤至周圍組織或進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)后，可引起中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間黏附作用的調(diào)節(jié)異常并上調(diào)白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)，導(dǎo)致血管內(nèi)白細(xì)胞淤滯、內(nèi)皮細(xì)胞受損和局部組織缺氧。組織的灌注不足有利于厭氧菌的生長，使氣性壞疽的病變范圍迅速擴(kuò)大。此外，α毒素還可引起嚴(yán)重的溶血和組織壞死。休克的發(fā)生與毒素的直接和間接作用有關(guān)。在體外試驗中，α毒素可直接抑制心肌的收縮力，可因心輸出量的急劇減少而造成低血壓。

6 展望

雖然已經(jīng)揭示了α毒素在氣性壞疽中的作用機(jī)理，但在人和動物非壞疽性疾病中的作用機(jī)制并沒有被完全闡明。動物中許多疾病的發(fā)生都與α毒素息息相關(guān)，尤其是α毒素能降低飼料中抗生素的水平。目前急需揭示α毒素在這些疾病中的作用機(jī)理，同時評價α毒素疫苗在預(yù)防這些疾病中的效果。為了支持這些研究，有必要闡明α毒素基因的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步了解環(huán)境因素刺激能否上調(diào)腸道和宿主組織中α毒素的產(chǎn)量，對于α毒素毒力分子基礎(chǔ)的了解，使我們能夠解釋α毒素和細(xì)胞膜相互作用的機(jī)制。然而仍舊有許多問題需要做進(jìn)一步的研究，比如底物特異性的分子基礎(chǔ)是什么，細(xì)胞膜是怎樣把磷脂填充到活性位點的，這些問題的解答有助于α毒素抑制劑在臨床上的應(yīng)用，尤其希望能開發(fā)出利用α毒素的抗腫瘤藥物。

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