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    活性肽的生理功能與制備方法研究進(jìn)展

    2014-01-26 12:29:12索江華李鳳玲郭春燕
    中國飼料 2014年23期
    關(guān)鍵詞:抗菌肽蛋白酶氨基酸

    索江華, 李鳳玲, 郭春燕

    (河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院,河南鄭州450011;2.晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山西榆次 030600)

    肽是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物,生物活性肽簡稱活性肽,是一類分子質(zhì)量小于6 000 kD,對動(dòng)物生長和生理機(jī)能有重要調(diào)控作用的肽。本文就活性肽的吸收機(jī)理、生理功能及其制備方法研究進(jìn)展作一簡述。

    1 活性肽的吸收機(jī)理

    蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),它是由一條或多條具有一定氨基酸序列的多肽鏈構(gòu)成的大分子。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,動(dòng)物日糧中蛋白質(zhì)的吸收即蛋白質(zhì)經(jīng)過胃腸道消化后變成游離的氨基酸吸收入血,再在各組織合成蛋白質(zhì),所以將動(dòng)物蛋白質(zhì)的營養(yǎng)看成是氨基酸的營養(yǎng)。因此,一些飼料廠家通過添加合成單一的氨基酸來降低飼料中蛋白質(zhì)的添加量,以節(jié)省成本。后來發(fā)現(xiàn)通過添加氨基酸,以理想蛋白質(zhì)模式配制的低蛋白質(zhì)日糧給動(dòng)物飼喂,不能取得最佳生產(chǎn)性能。隨著蛋白質(zhì)技術(shù)和理論的發(fā)展,其吸收機(jī)制也有新的觀點(diǎn)。Smyth和Newey(1962)認(rèn)為二肽可以被完整吸收。Gardner(1982)研究證實(shí),二肽甚至更長肽鏈可以被完整吸收。二肽與三肽已經(jīng)被證明吸收的效率比氨基酸高(Nakata等,1995)。目前認(rèn)為活性肽的吸收需要載體,分別為肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體Ⅰ和肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體Ⅱ,這兩種載體都能轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽(Matthews,2000)。轉(zhuǎn)運(yùn)體系有三類:一是依賴pH的Na+/H+交換轉(zhuǎn)運(yùn)體系,不消耗ATP(張翠玲,2014)。Takuwa等(1985)發(fā)現(xiàn)肽在刷狀緣膜處轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)出現(xiàn)了H+濃度梯度。 Garapathy 等(1985)、Matthews(1987)提出肽轉(zhuǎn)運(yùn)的驅(qū)動(dòng)力是細(xì)胞膜兩側(cè)的H+梯度。二是依賴H+或Ca2+的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),需要消耗ATP。三是谷胱甘肽(GSH)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。由于谷胱甘肽在生物膜內(nèi)具有抗氧化的作用,其轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)具有特殊的生理意義。肽的吸收與其構(gòu)型有密切關(guān)系,與氨基酸的吸收互不影響,其轉(zhuǎn)運(yùn)具有耗能低、轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、載體不容易飽和等優(yōu)點(diǎn)。

    2 活性肽的功能

    2.1 抵抗外源性微生物入侵的作用 生物體為了抵御體外微生物入侵而產(chǎn)生的一類活性多肽被稱作抗菌肽??咕氖且活愋》肿雨栯x子短肽的總稱。Boman等(1993)通過注射陰溝桿菌及大腸桿菌誘導(dǎo)蠶蛹產(chǎn)生了具有抗菌活性的多肽。到目前為止科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在植物、昆蟲、微生物、被囊動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、鳥類、魚類、哺乳動(dòng)物,乃至人類等多種生物體中發(fā)現(xiàn)并分離獲得了多種抗菌肽(滕勇和滕尚輝,2003)。

    2.1.1 抗菌作用 天然生物抗菌肽抗菌譜廣,既抑制革蘭氏陽性菌,又對革蘭氏陰性菌起到很好的 抑 制 作 用 (Brofdenk,2005;Vizioli 和 Salzet,2002),特別是對多重耐藥菌具有殺傷作用(劉倚帆等,2010)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗真菌肽有cecropins、果蠅抗菌肽、線肽素、貽貝素、蝎血素以及人工改造的各種抗菌肽等(楊陽等,2010)。天蠶素在25~100 mg/L時(shí)對鐮刀菌屬和曲霉菌屬的病原菌有殺滅作用(Delucca等,1997)。

    抗菌肽抑菌的作用機(jī)制主要有:一是破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性,使其通透性增強(qiáng),造成胞內(nèi)物質(zhì)外溢導(dǎo)致細(xì)菌死亡。二是抗菌肽引起細(xì)菌形態(tài)的改變(Pandey等,2011)。 Lee等(1998)用天蠶素 A和蜂毒素分子的片段合成雜合肽分子,處理真菌孢子原生質(zhì)體,發(fā)現(xiàn)真菌細(xì)胞正常形態(tài)被破壞。三是作用于胞內(nèi)靶點(diǎn)的殺菌機(jī)制??咕囊志饔迷诎麅?nèi)主要表現(xiàn)為:(1)干擾細(xì)胞壁的合成。人源抗菌肽LL-37攻擊單個(gè)大腸桿菌的過程中,發(fā)現(xiàn)其干擾分裂隔膜處細(xì)胞壁的合成來發(fā)揮殺菌作用(PNAS,2011)。 (2)影響蛋白質(zhì)的合成。Yenugu 等(2004)發(fā)現(xiàn)抗菌肽處理的大腸桿菌也能抑制其蛋白質(zhì)的合成。 (3)抑制酶的活性(Brogdenk,2005)。(4)改變細(xì)胞質(zhì)膜。 (5)與 DNA 結(jié)合,抑制 DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成。Nan等(2009)通過對indolicidin的修飾,發(fā)現(xiàn)其類似物能透過大腸桿菌質(zhì)膜,并在胞內(nèi)積累與DNA分子結(jié)合。螺旋抗菌肽和一些富含脯氨酸和精氨酸的抗菌肽進(jìn)入到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)后,與胸腺嘧啶、尿嘧啶等結(jié)合,抑制 DNA、RNA 合成(Boman,1993)。

    2.1.2 抗病毒作用 抗菌肽抗病毒機(jī)制主要表現(xiàn)在以下幾方面:(1)病毒有膜結(jié)構(gòu)與病毒外膜結(jié)合抑制病毒的作用。如α-防御素對皰疹病毒的作用;美洲鱟素對HIV病毒的作用(Andreu,1999)。(2)抑制病毒的繁殖。如天蠶素A在亞毒性濃度下通過抑制基因表達(dá)來阻遏HIV-1病毒的增殖(趙潔等,2008;Wachinger等,1998)。

    2.2 對免疫活性的影響

    2.2.1 增強(qiáng)免疫活性 能夠增強(qiáng)免疫活性作用的肽被稱作免疫活性肽,其主要是起到免疫調(diào)節(jié)作用,不僅影響機(jī)體的免疫系統(tǒng),也影響免疫反應(yīng)和免疫細(xì)胞之間相互作用,維持機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定,提高機(jī)體免疫力。免疫活性肽的作用機(jī)制有以下幾個(gè)方面:(1)刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖。Risso等 (1998)報(bào)道,Nisin可誘導(dǎo)CD4和CD8細(xì)胞的產(chǎn)生,增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能和T細(xì)胞的輔助功能。(2)調(diào)節(jié)免疫因子的活性。當(dāng)受到外源菌入侵時(shí),活性肽可促使肥大細(xì)胞脫?;?,釋放組胺,使血管舒張,促使釋放入血的有關(guān)免疫細(xì)胞增多,具有潛在的消滅感染細(xì)胞的能力。研究發(fā)現(xiàn)α-防御素可促使大鼠腹腔肥大細(xì)胞脫粒,作為單核細(xì)胞的趨化因子,抑制糖皮質(zhì)激素合成以及促進(jìn)上皮細(xì)胞的有絲分裂 (Oppenheim等,2003)。另外,傷口感染病菌后,可以通過激活纖維蛋白酶原來抑制纖維蛋白凝塊溶解 (李波,2014)。對NK細(xì)胞具有激活作用,梁再賦(2013)報(bào)道地龍肽在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中都有增加巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性和NK細(xì)胞的殺傷活性,提高巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞分泌NO、TNF-α的水平,增加巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

    2.2.2 抑制免疫活性 有些肽對免疫具有明顯的抑制作用。這一類肽主要應(yīng)用于治療自身免疫性疾病和預(yù)防抑制排斥反應(yīng)。如環(huán)孢菌素A是十一環(huán)肽,已經(jīng)在器官移植和自身免疫疾病中用作抗炎癥和殺真菌的免疫抑制劑(宋長征,1992)。

    2.3 抗氧化作用 抗氧化作用主要通過清除重金屬離子以及與自由基或者可能成為自由基的過氧化物發(fā)生氧化還原反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。天然的抗氧化活性肽有肌肽、谷胱甘肽,另外還有大豆蛋白酶解物等,可以抑制體內(nèi)血紅蛋白、脂氧合酶和體外單線態(tài)氧催化的脂肪酸敗的作用。如谷胱甘肽,其作用主要有清除自由基,因在其結(jié)構(gòu)中含有-SH,容易被體內(nèi)代謝的自由基氧化失去氫而轉(zhuǎn)變?yōu)槠溲趸凸入赘孰?,還原的自由基不再損傷生物膜或者侵害生命大分子物質(zhì),從而起到保護(hù)生命體的作用。肌肽是主要存在于動(dòng)物肌肉中的天然二肽,具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)酶活力的作用,主要是通過直接捕獲活性氧成分和自由基、螯合金屬離子等實(shí)現(xiàn)抗氧化作用(韓立強(qiáng),2004)??寡趸挠幸种剖澄镌诶洳貢r(shí)的氧化酸敗,在肉制品加工中具有極好的應(yīng)用前景,且具有高效、低毒等特點(diǎn),能作為天然抗氧化劑使用。

    2.4 促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收

    2.4.1 提高日糧蛋白質(zhì)在體內(nèi)的沉積量 氨基酸和小肽的吸收機(jī)制不同,Hefarty等(1982)研究了蛋白水解物和氨基酸的吸收差異,研究結(jié)果表明相同條件下氨基酸和多肽吸收機(jī)制不同,肽的氨基酸殘基吸收優(yōu)于氨基酸。氨基酸以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式吸收,是逆梯度進(jìn)行,必須依靠鈉離子泵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)吸收,需要消耗大量的ATP;而小肽吸收是被動(dòng)吸收,二者互不干擾,有助于蛋白質(zhì)在體內(nèi)的沉積。Pharagyn和 Barley(1987)報(bào)道,當(dāng)精氨酸和賴氨酸以游離形式存在時(shí),兩者相互競爭吸收位點(diǎn),游離的精氨酸有降低肝門靜脈對賴氨酸吸收的傾向;而精氨酸以肽形式存在時(shí),賴氨酸對其吸收則無影響。

    2.4.2 促進(jìn)礦物質(zhì)元素吸收 施用暉等 (1996)研究發(fā)現(xiàn),在蛋雞日糧中添加小肽類物質(zhì),血液中的Fe2+、Zn2+含量顯著高于對照組,同時(shí)也提高蛋殼強(qiáng)度。目前已經(jīng)證明酪蛋白磷酸肽,是以磷酸絲氨酸為活性中心的肽。通過磷酸絲氨酸與鈣、鋅、鐵等二價(jià)金屬離子形成可溶性的螯合物,促進(jìn)金屬離子由小腸腸壁細(xì)胞被動(dòng)擴(kuò)散,吸收后再釋放出來,從而有效地避免了鈣在小腸中性和偏堿性環(huán)境中被沉淀,促進(jìn)了鈣的吸收(Reeves等,1958),此外,酪蛋白磷酸肽還可作為錳、銅及硒等礦物質(zhì)元素的載體,是一種良好的金屬結(jié)合肽。

    2.5 抗高血壓作用 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)在血壓調(diào)節(jié)過程起到了重要的作用,抑制ACE活性對降低血壓有很好的效果,部分活性肽能起到降低血壓的作用,稱為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(ACEI)(辛志宏和馬海樂,2003)。 Yasun (1996)用Calpis發(fā)酵劑發(fā)酵的酸奶飼喂自發(fā)性高血壓大鼠(SHR),在4~8 h后,SHR的收縮壓降低2.36 MPa以上。隨后又對組織中的ACE酶的活性進(jìn)行了檢測,結(jié)果主動(dòng)脈中ACE酶的活性降低最多,并發(fā)現(xiàn)SHR的主動(dòng)脈中有兩條三肽(IPP和VPP)起到了降低血壓的作用,推測其抗高血壓作用可能與主動(dòng)脈中的ACE降低有關(guān)。Ferreira和Rocha(1965)從天然蛇毒中發(fā)現(xiàn)抑制ACE肽類。Oshima等(1979)選擇了細(xì)菌膠原酶降解膠原蛋白獲得了有較強(qiáng)抑制血管素轉(zhuǎn)化酶的肽,并測出其分子量(在1 000 D以下)和氨基酸組成。 Maruyama(1987、1982)從牛酪蛋白中也成功地獲得了ACEI肽,隨著研究的深入,又從玉米蛋白、沙丁魚、磷蝦、大豆蛋白等中發(fā)現(xiàn)新的ACEI活性肽(吳建平,1998)。目前降血壓肽多數(shù)來源于乳制品(吳建平,2012)。

    3 生物活性肽的制備方法

    3.1 生物提取法 因?yàn)樯矬w內(nèi)富含一些激素類或酶抑制劑等各種天然活性肽,通過一定的工藝對其進(jìn)行分離提取,如:從酵母中和小麥胚芽中提取谷胱甘肽。因?yàn)樘烊换钚噪牡暮康停朔ㄝ^適合用于初步的探索性研究。

    3.2 酶水解法 酶水解法是利用酶在最適pH值、最適溫度下進(jìn)行酶催化的水解反應(yīng),根據(jù)酶的特異性,使蛋白質(zhì)水解為不同的肽段,從而得到目標(biāo)肽。大多數(shù)活性肽的生產(chǎn)流程為:原料蛋白→預(yù)處理→酶解→分離→精制→成品(杜林和李亞娜,2005)。原料的選擇是基礎(chǔ),根據(jù)目標(biāo)肽的氨基酸組成或結(jié)構(gòu)來選擇廉價(jià)農(nóng)副產(chǎn)品或者廢水廢物作為原料,如油廠的餅粕類、酒廠的酒糟等。蛋白酶的選擇是關(guān)鍵,要求酶既要切出需要的肽段,又要符合食品安全。酶主要有微生物來源、動(dòng)物來源及植物來源。微生物來源的酶包括酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶及復(fù)合酶;動(dòng)物性蛋白酶包括胃蛋白酶和胰酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、彈性蛋白酶);植物蛋白酶有菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶。隨著酶工程的發(fā)展,根據(jù)需要的活性肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),可用酶工程生產(chǎn)特定的酶類 (Gauthier和 Poulit,2003)。此法因?yàn)樯a(chǎn)條件溫和,易于控制,且氨基酸的營養(yǎng)價(jià)值沒有被破壞,隨著發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展,蛋白酶的生產(chǎn)量加大,成本降低。

    3.3 微生物發(fā)酵法 微生物法是利用有益的菌株,接種在蛋白質(zhì)中,進(jìn)行發(fā)酵,菌株分泌的蛋白酶可以將蛋白切成需要的活性肽,再進(jìn)行分離提取得到目標(biāo)肽。根據(jù)酶學(xué)特性和對底物蛋白分子的利用不同,把菌株進(jìn)行不同組合,生產(chǎn)合適的肽段。這種方法的關(guān)鍵是菌株的篩選。

    3.4 人工合成活性肽

    3.4.1 化學(xué)合成法 依據(jù)目標(biāo)肽的氨基酸排列順序,通過化學(xué)方法來合成。根據(jù)合成的介質(zhì)分為液相合成和固相合成。液相合成法是合成小分子肽濃縮多肽片段較好的方法。固相合成法優(yōu)點(diǎn)是固相載體有利于合成中肽鏈的固定、環(huán)化、去保護(hù)和純化,但成本較高,副反應(yīng)及殘留化合物多,限制了規(guī)?;a(chǎn)。

    3.4.2 重組DNA技術(shù) 通過重組DNA,合成需要的肽段,一旦建立起重組DNA體系,就能生產(chǎn)大量的活性肽。但研發(fā)階段要求很高,成本昂貴(吳建平,1998)。

    4 前景及展望

    有關(guān)活性肽生理功能的研究越來越廣泛,對活性肽的吸收、代謝研究越來越深入,其應(yīng)用范圍也更加廣闊。目前我國原料利用率不高,許多產(chǎn)品的下腳料或者廢棄物中都有豐富的蛋白質(zhì)資源,通過其制備活性肽,不但成本低廉,而且大大減少了廢棄物排放對環(huán)境造成的污染。活性肽易吸收、生物學(xué)功能廣、抗菌效果好,無殘留等特性,加上生產(chǎn)低廉,將會產(chǎn)生深遠(yuǎn)的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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