RNA干擾技術在植物品質改良和病蟲害防治中的應用

王愛英，傅 強，賴鳳香，王渭霞

(中國水稻研究所水稻生物學國家重點實驗室，浙江 杭州 310006)

RNA干擾 (RNA interference，RNAi)是指內源性或外源性雙鏈 RNA(double-stranded RNA，dsRNA)導致細胞內同源mRNA發(fā)生特異性降解的過程［1］。其發(fā)現(xiàn)可追溯到1990年，為培育顏色更深的紫色矮牽?；?，將查耳酮合酶基因轉入牽牛花中，結果許多花朵的顏色不但沒有加深，反而變成白色或花白色，這種現(xiàn)象被稱為共抑制 (cosuppression)。這種共抑制現(xiàn)象之后被確認是發(fā)生在轉錄后水平，因此又稱為轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)［2］。RNAi現(xiàn)象普遍存在于真菌、果蠅、線蟲、渦蟲、植物及動物等大多數(shù)真核生物中，它可以阻斷生物體內特定基因的表達，從而使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，是一種在進化上高度保守的調節(jié)機制［3-4］。隨著科學研究的深入，人們已經(jīng)從多種生物中分離出參與RNAi的一些關鍵基因，也對RNAi產(chǎn)生的基本機制有了較深入的了解，RNAi在植物品質改良和病蟲害防治上的應用也已取得豐碩成果。隨著研究的不斷深入，RNAi將在植物學研究領域發(fā)揮越來越重要的作用。

1 機制和特點

1.1 機制

在大量的生化和遺傳學研究基礎上，植物學家逐步總結出了植物的RNAi作用機制模型，認為RNAi可以分為以下3個階段:起始階段、效應階段和擴增階段。在起始階段，dsRNA是誘導細胞產(chǎn)生RNAi的關鍵成分，轉基因、病毒感染及轉座子活動等都能使細胞產(chǎn)生dsRNA。這些dsRNA在內切核酸酶作用下，經(jīng)由 Dicer(DICER-like，DCL)酶將dsRNA處理為21～25 nt大小的siRNA(small-interference RNA)。起始階段產(chǎn)生的siRNAs的一條鏈與RNA沉默復合物結合 (RNA-induced silencing complex，RISC)，從而阻斷基因的表達。之后，以mRNA為模板，siRNA為引物，在RNA依賴 的 RNA聚 合 酶 (RNA-directedRNA polymerase，RdRp)作用下，通過類似PCR的擴增作用再次形成dsRNA，dsRNA又被Dicer切割產(chǎn)生次級siRNA，次級siRNA又進入下輪循環(huán)，這樣就產(chǎn)生了一種級聯(lián)放大的效應［5］。

1.2 特點

1.2.1 RNAi的序列特異性

導入到生物體內的siRNA上的一對堿基突變就會抑制沉默效應，表明RNAi具有高度的序列特異性［6］。轉化大麥黃矮 (BYDV2PAV)的多聚酶基因反向重復序列載體 (hp BYDVpol)的轉基因植株，僅對大麥黃矮病毒免疫，而對谷類該病毒感染，也從另一面證明了RNAi技術的序列特異性［7］。RNAi高度的序列特異性使得dsRNA只能特異地降解與之序列同源的mRNA，而不會對其他基因產(chǎn)生影響，從而保證了對目的基因的精確沉默。

1.2.2 RNAi的高效性

RNAi存在級聯(lián)放大效應，雙鏈RNA在Dicer酶催化下形成siRNA，siRNA解鏈后一種是直接靶向結合mRNA，另一種是解鏈后與RISC形成復合物，這些RISC可以專一性地與靶向的mRNA特異性結合。根據(jù)單鏈siRNA結合位點或RISC結合位點，在RDRP(RNA依賴性的RNA聚合酶)作用下可以形成新的雙鏈RNA，后者被Dicer酶特異性地識別而將雙鏈RNA切斷，形成新的siRNA而再循環(huán)作用于靶向mRNA。RNAi途徑一旦被啟動，就可以高效沉默基因的表達，因此每個細胞只需少量的dsRNA就可以使目標基因沉默［8］。向細胞內導入針對多個基因的dsRNA，還可以一次性沉默多個基因。此外，與棕櫚酸結合的C16-dsRNAs具有很高的膜通透性，而且具有很高的基因沉默效率［9］。由此可見，RNAi過程具有類似生物催化酶反應的高效性。

1.2.3 RNAi的擴散性和可遺傳性

RNAi的擴散性是指沉默信號可以沿其同源序列的DNA向該目的基因的非同源區(qū)域擴散，或者指沉默信號從一個已經(jīng)發(fā)生沉默的細胞內轉到新的細胞里。目前已證實，在植物RNAi過程中siRNA充當沉默信號［10］。對植物細胞RNAi運動的研究表明，RNAi信號是可以傳輸給附近有限細胞的。但是，要進行細胞之間長距離運輸?shù)脑?，就需要借助于SDE1(一類RDRP酶)和sDE(一類RNA螺旋酶)之間的相互作用，以及胞間連絲的參與［11-12］。通過嫁接，沉默信號可以在砧木和接穗之間雙向傳遞;而且沉默信號可以在不同的物種個體間傳遞，如植物與取食植物的昆蟲之間;此外，沉默效應甚至可以傳遞給后代［13］。

1.2.4 RNAi的高穩(wěn)定性和不對稱性

siRNA的3'端有突出的TT或UU堿基，因此化學性質很穩(wěn)定，無需像反義核苷酸那樣進行廣泛的化學修飾以提高半衰期［1］。在RNAi作用中有一個關鍵的步驟，就是RISC的裝配，RISC可以調控目標RNA的降解。然而，RISC在裝配過程中具有不對稱性，siRNA的2條鏈并不都能組裝成RISC復合體，這取決于siRNA 2條鏈5'端堿基對所具有的特點［14］。

2 在植物品質改良中的作用

隨著RNAi機理的不斷闡明及將dsRNA引入植物細胞的方法取得成功，采用RNAi技術進行作物品質改良已顯現(xiàn)出巨大的潛力。目前，利用RNAi技術已經(jīng)成功地進行了多種作物不同方面的品質改良，現(xiàn)綜述如下。

2.1 提升農(nóng)作物品質

2.1.1 改良油脂品質

各類脂肪酸組分及其比例是決定農(nóng)作物油脂品質的重要指標之一，提高種子中油酸和硬脂酸含量是植物油脂基因工程改良的一個主要目標。研究表明，利用RNAi技術可將棉花籽油中硬脂酸含量從非轉基因的2%～3%提高到40%，油酸含量從15%提高到77%［15-16］。將脂肪酸脫氫酶基因沉默，可以使甘藍型油菜和芥菜型油菜中的油酸含量分別升高到 89%和 75%［17］。研究人員還利用RNAi技術獲得了油菜FAE1基因功能缺失的突變體，可以調控芥酸含量，從而提高菜油的營養(yǎng)價值［18］。

2.1.2 改良淀粉品質

淀粉是重要的工業(yè)原料，利用RNAi技術改變代謝的物質流方向，來提高工業(yè)加工原料在作物中的含量，是一種十分有效的方法。通過RNAi調控玉米淀粉支酶 (SBE)基因，可將直鏈淀粉的含量提高約50%［19］。抑制小麥 SBEIIa和 SBEIIb基因表達，可使籽粒直鏈淀粉含量提高到70%以上，更有利于人體健康［20］。將紅薯Waxy基因沉默，可以培育出低直鏈淀粉含量的轉基因個體［21］。通過RNAi轉基因技術，研究人員還獲得了極限糊精酶活性只有野生型10%的轉化株系，有望培育出高淀粉含量的水稻［22］。

2.1.3 提高植物營養(yǎng)物質或有效成分

通過RNAi技術對番茄的光信號傳導基因LeHY5和LeCOPILIKE進行調控，可以大幅度改變番茄果實的色素積累和營養(yǎng)品質［23］。抑制番茄DET1(一類內源性光形態(tài)發(fā)生作用調控基因)基因提高了番茄類胡蘿卜素和黃酮醇這兩種營養(yǎng)物質的含量［24］。抑制Lyeε環(huán)化酶活性的轉基因馬鈴薯塊莖中β-胡蘿卜素的含量增加了14倍，類胡蘿卜素總量增加了2.5倍［25］。此外，應用RNAi技術還得到了高質量的富含賴氨酸的玉米種子［26］。

利用RNAi技術抑制藥用植物無藥效產(chǎn)物合成途徑上的一些關鍵酶基因表達，可以減少甚至抑制無藥效產(chǎn)物的生物合成，從而提高藥用植物品質。如應用RNAi技術抑制罌粟中可待因酮還原酶基因家族基因的表達，可以極大地提高罌粟中含嗎啡的量［27］。抑制黃連中異喹啉生物合成途徑中金黃紫堇堿90甲基轉移酶基因的表達，可以使該酶的表達水平明顯降低［28］。敲除罌粟細胞中BBE基因可以積累大量的牛心果堿［29］。沉默艾草中的鯊烯合酶SQS，可以使植株中的一種抗瘧疾藥物 (青蒿素)含量顯著增加［30］。

2.1.4 降低植物有害物質含量

應用RNAi技術抑制咖啡植物中編碼可可堿合成酶基因的表達，可以使轉基因植物中可可堿含量下降30%～80%，咖啡因含量下降50%～70%，有利于降低對咖啡因敏感人群的刺激，并可減少因食用咖啡而引發(fā)的心悸、高血壓、失眠等癥狀［31］。抑制亞麻苦苷和百脈根苷合成途徑中的兩個關鍵酶CYP79D1和CYP79D2的表達，得到的轉基因木薯塊莖中氰苷含量降低92%、葉片中氰苷含量低于野生型氰苷含量的1%，極大改善了木薯的營養(yǎng)價值［32］。抑制棉籽中棉酚合成途經(jīng)中δ-杜松烯合成基因的表達可使棉籽中棉酚含量降低99%，而葉片及花中的萜類化合物并不會因此減少，其對病害及昆蟲的抗性亦無明顯降低［33］。抑制產(chǎn)生催淚因子的LF合酶的活性，可以產(chǎn)生不使人流淚的洋蔥［34］。沉默煙草中的脫甲基酶基因，去甲煙堿的含量僅為對照的1/7，能導致動物發(fā)生癌變的NNN含量也明顯降低［35］。

2.2 改良園藝植物的性狀

植物花的顏色和香味因其巨大的經(jīng)濟價值和審美價值，一直以來都是園藝植物育種研究的熱點。牽?；ㄖ胁闋柾悩嬅?(CHI)基因促使花瓣顏色加深，康乃馨中的CHI活性降低會使得黃色素沉著［36］。抑制查爾酮異構酶 (CHI)基因促使煙草花瓣的顏色由白色變成粉白色［37］。在郁金香中過量表達TgVitl基因和抑制TgFER1基因的表達，致使郁金香花底部的藍色出現(xiàn)非常明顯的變化［38］。抑制矮牽牛中的松柏醇?；D移酶的活性，可使牽?；ǖ南阄栋l(fā)生改變［39］。

2.3 提高植物果實的品質

植物果實的品質主要包括營養(yǎng)價值、果實味道、加工質量和果實的貨架期。植物果實成熟過程中，由乙烯誘發(fā)的信號級聯(lián)和相關基因共同參與調控植物果實的成熟以至腐爛變質［40］。應用 RNAi技術干擾番茄乙烯相關的ACC氧化酶基因，結果有69%的轉化植株表現(xiàn)出100%的干擾效果，果實從破色期到成熟期時間延長115 d［41］。干擾番茄ACO基因，導致乙烯的生成大大降低，由于RNAi技術能有效抑制靶基因的表達，因此是改良番茄耐貯性的有效手段［42］。多酚氧化酶 (PPO)是植物體內普遍存在的一種酶，PPO所引起的反應常使果肉發(fā)生褐變，損失營養(yǎng)。同時用反義RNA技術和sense RNAi技術抑制PPO活性，可以有效控制馬鈴薯的褐變［43］。

此外，有些植物果實中含有堅硬的種子而且味道很差，而近年來，無籽果實更受消費者青睞。應用RNAi技術抑制番茄中ARF7基因的表達，可以獲得轉基因無籽番茄［44］。抑制植物AUCSIA基因的表達，可以獲得無籽果實，而且果實中查爾酮合成酶的含量降低［45］。

3 在植物病蟲害防治中的應用

3.1 抗病

研究表明，RNAi是植物抵抗病毒感染的防御機制之一。目前，許多研究已經(jīng)可以利用RNAi方法控制單鏈DNA或RNA病毒［46］。研究人員利用RNAi技術獲得了對黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)具有系統(tǒng)抗性的植株，并能在植株體內檢測到CP序列特異的siRNA［47］。沉默水稻矮縮病毒的一個病毒原質基質蛋白基因Pns12，結果轉基因水稻獲得了對該病毒的抗性［48］。此外，研究人員還獲得了對苜?；ㄈ~病毒、豆莢斑點病毒和大豆花葉病毒都具有抗性的轉基因植株［49］。利用RNAi研究水稻條紋病毒 (RSV)，構建了針對RSV外殼蛋白和疾病特異性蛋白的兩種沉默表達載體，然后將它們導入水稻植株，結果轉基因水稻對RSV 的抗性顯著增加［50］。

利用兩種根癌農(nóng)桿菌介導的iaam和ipt基因沉默，可以減少擬南芥冠纓瘤的形成。此外，基于RNAi的研究還發(fā)現(xiàn)，水稻中OsRAR1基因兼抗稻瘟病菌和細菌性疫?。?1］，表明真核生物宿主細胞不僅可以通過 RNAi防御病毒侵染，也能利用siRNA防御細菌侵染，這對植物細菌性病害的防治有積極意義。

線蟲在取食RNAi植物后，相應的4個甜菜孢囊線蟲線蟲基因表達豐度顯著降低，且成熟雌性線蟲減少23% ～64%［52］。將酪氨酸磷酸酶 (TP)和線粒體應激70蛋白前體 (MSP)的RNAi結構導入大豆根部，由根結線蟲引起的蟲癭減弱，同時根結線蟲與對照組相比個體也明顯變?。?3］。將南方根結線蟲POS-1基因的dsRNA接種到番茄的根部，接著用根結線蟲侵染根部發(fā)現(xiàn)，根結線蟲的孵化率與對照組相比明顯降低［54］。

3.2 抗蟲

在植物抗蟲方面，利用RNAi也取得了很多研究進展。為了有效地控制害蟲，害蟲應該能夠自然地通過飼喂和消化獲得dsRNA/siRNA［55］。通過飼喂轉基因植物誘導RNAi防治害蟲已在鱗翅目和鞘翅目昆蟲中試驗成功［56-57］。

研究發(fā)現(xiàn)表達P450基因 (CYP6AE14)和谷胱甘肽基因 (GST1)dsRNA的棉花對取食的棉鈴蟲(H.armigera)幼蟲誘導了RNAi，阻礙了幼蟲的發(fā)育，這一技術為防治農(nóng)作物害蟲提供了新的策略［58］。研究人員利用RNAi研究了褐飛虱的中腸基因，他們將3種中腸基因的dsRNA導入水稻植株，然后喂食褐飛虱，結果發(fā)現(xiàn)，褐飛虱中這3種基因的表達都受到抑制，但是褐飛虱并沒有出現(xiàn)致命性死亡［59］。以上研究表明，在植物中表達與昆蟲同源的雙鏈RNA，可以觸發(fā)取食昆蟲體內發(fā)生RNA干擾，進而影響昆蟲生長甚至殺死昆蟲。而且利用RNAi技術防治害蟲具有很高的特異性，不會對其他有益昆蟲產(chǎn)生影響，RNAi在農(nóng)作物遺傳改良進行精準抗蟲方面具有重大的應用前景。

4 展望

RNAi介導的基因沉默是植物在基因調控水平上的自我保護機制，是一種高效、特異性強的基因阻斷技術，在作物品質改良、病蟲害防治等方面發(fā)揮著重要作用。轉BT基因的作物已成功控制了多種害蟲危害，但是目前也已見對BT產(chǎn)生抗性的報道［60］。將RNAi技術和BT技術同時應用來控制害蟲是一個新的防治策略。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，通過體壁吸收dsRNA可導致亞洲玉米螟的生長發(fā)育遲緩和死亡，表明雙鏈RNA能夠通過鱗翅目昆蟲的體壁，影響幼蟲發(fā)育并最終導致死亡［46］，這也為今后的昆蟲防控提供了一個新的視角和思路。

在昆蟲中，可以應用大量的dsRNA來實現(xiàn)基因沉默，研究表明，50 ng·mg-1組織的濃度對哺乳動物尚無明顯的副作用［61］。雖然基因的差異是一個重要因素，但昆蟲和哺乳動物的dsRNA用量還需進一步的研究。

傳統(tǒng)農(nóng)作物作為主食，被人們大量食用，但有些食物成分會引起消化不良甚至誘發(fā)中毒。應用RNAi技術可以在一定程度上提高農(nóng)作物的營養(yǎng)成分，并能從可食用部分去除天然有毒化合物，從而確保營養(yǎng)安全，保障人們的飲食健康［62］。隨著人們對RNAi技術的深入研究，該技術必將在植物學研究的各領域發(fā)揮日益重要的作用。

［1］Elbashir S M，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammaliancells ［J］. Nature， 2001， 411(6836):494-498.

［2］Napoli C，Lemieux C，Jorgensen R.Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans［J］.The Plant Cell Online，1990，2(4):279-289.

［3］Sharp P A. RNA interference-2001 ［J］. Genes ＆Development，2001，15(5):485-490.

［4］和瓊姬，燕飛，陳劍平.RNA干擾機制及其主要蛋白因子研究進展［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2011，23(2):415-420.

［5］Sijen T，F(xiàn)leenor J，Simmer F，et al.On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing ［J］.Cell，2001，107(4):465-476.

［6］Brummelkamp T R，Bernards R，Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］.cience，2002，296(5567):550-553.

［7］Wang M B，Abbott D C，Waterhouse P M.A single copy of a virus‐derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to Barley yellow dwarf virus ［J］.Molecular Pant Pahology，2000，1(6):347-356.

［8］Brantl S.Antisense-RNA regulation and RNA interference［J］.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Gene Structure and Expression，2002，1575(1):15-25.

［9］Kubo T，Yanagihara K，Takei Y，et al.Lipid-conjugated 27-nucleotide double-stranded RNAs with dicer-substrate potency enhanceRNAi-mediated gene silencing ［J］. Molecular Pharmaceutics，2012，9(5):1374-1383.

［10］Dunoyer P，Schott G，Himber C，et al.Small RNA duplexes function as mobile silencing signals between plant cells［J］.Science，2010，328(5980):912-916.

［11］Himber C，Dunoyer P，Moissiard G，et al.Transitivity ‐dependent and‐independent cell‐to‐cell movement of RNA silencing ［J］.The EMBO Journal，2003，22(17):4523-4533.

［12］Mallory A C，Mlotshwa S，Bowman L H，et al.The capacity of transgenic tobacco to send a systemic RNA silencing signal depends on the nature of the inducing transgene locus ［J］.The Plant Journal，2003，35(1):82-92.

［13］Melnyk C W，Molnar A，Baulcombe D C.Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals ［J］.The EMBO Journal，2011，30(17):3553-3563.

［14］Schwarz D S，Hutvágner G，Du T，et al.Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex ［J］.Cell，2003，115(2):199-208.

［15］Liu Q，Singh S，Green A.Genetic modification of cotton seed oil using inverted-repeatgene-silencing techniques［J］.Biochemical Society Transactions，2000，28(6):927.

［16］Liu Q，Singh S P，Green A G.High-stearic and high-oleic cottonseed oilsproduced by hairpin RNA-mediated posttranscriptional gene silencing ［J］.Plant Physiology，2002，129(4):1732-1743.

［17］Stoutjesdijk P A，Singh S P，Liu Q，et al.hpRNA-mediated targeting of the Arabidopsis FAD2 gene gives highly efficient and stable silencing ［J］.Plant Physiology，2002，129(4):1723-1731.

［18］田保明，陳占寬，楊光圣，等.基于RNAi技術轉移脂肪酸延長酶基因fae1及轉基因油菜的獲得［J］.中國油料作物學報，2007，29(2):133-137.

［19］柴曉杰，王丕武，關淑艷，等.應用 RNA干擾技術降低玉米支鏈淀粉含量［J］.植物生理與分子生物學學報，2006，31(6):625-630.

［20］Regina A，Bird A，Topping D，et al.High-amylose wheat generated by RNA interference improves indices of large-bowel health in rats［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103(10):3546-3551.

［21］Shimada T，Otani M，Hamada T，et al.Increase of amylose content of sweetpotato starch by RNA interference of the starch branching enzyme II gene(IbSBEII)［J］ .Plant Biotechnology，2006，23(1):85-90.

［22］黃冰艷，李忠誼，吉萬全，等.利用RNA干擾技術抑制水稻淀粉極限糊精酶基因表達 ［J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報，2007，15(1):71-75.

［23］Liu Y，Roof S，Ye Z，et al.Manipulation of light signal transduction as a means of modifying fruit nutritional quality in tomato ［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences oftheUnited StatesofAmerica， 2004， 101(26):9897-9902.

［24］Davuluri G R，Van Tuinen A，F(xiàn)raser P D，et al.Fruit-specific RNAi-mediated suppression of DET1 enhances carotenoid and flavonoid content in tomatoes ［J］.Nature Biotechnology，2005，23(7):890-895.

［25］Diretto G，Tavazza R，Welsch R，et al.Metabolic engineering of potato tuber carotenoids through tuber-specific silencing of lycopene epsilon cyclase ［J］.BMC Plant Biology，2006，6(1):13.

［26］Huang S，F(xiàn)rizzi A，F(xiàn)lorida C A，et al.High lysine and high tryptophan transgenic maize resulting from the reduction of both 19-and 22-kD α-zeins ［J］.Plant Molecular Biology，2006，61(3):525-535.

［27］Allen R S，Millgate A G，Chitty J A，et al.RNAi-mediated replacement of morphine with the nonnarcotic alkaloid reticuline in opium poppy ［J］.Nature Biotechnology，2004，22(12):1559-1566.

［28］Dubouzet J G，Morishige T，F(xiàn)ujii N，et al.Transient RNA silencing of scoulerine 9-O-methyltransferase expression by double stranded RNA in Coptis japonica protoplasts ［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2005，69(1):63-70.

［29］Fujii N，Inui T，Iwasa K，et al.Knockdown of berberine bridge enzyme by RNAi accumulates(S)-reticuline and activates a silent pathway in cultured California poppy cells ［J］.Transgenic Research，2007，16(3):363-375.

［30］Zhang L，Jing F，Li F，et al.Development of transgenic Artemisia annua(Chinese wormwood)plants with an enhanced content of artemisinin，an effective anti‐ malarial drug，by hairpin‐RNA‐mediated gene silencing［J］.Biotechnology and Applied Biochemistry，2009，52(3):199-207.

［31］Ogita S，Uefuji H，Yamaguchi Y，et al.RNA interference:producing decaffeinated coffee plants ［J］.Nature，2003，423(6942):823.

［32］J?rgensen K，Bak S，Busk P K，et al.Cassava plants with a depleted cyanogenic glucoside content in leaves and tubers.Distribution of cyanogenic glucosides，their site of synthesis and transport，and blockage of the biosynthesis by RNA interference technology ［J］. PlantPhysiology， 2005， 139 (1):363-374.

［33］Sunilkumar G，Campbell L A M，Puckhaber L， et al.Engineering cottonseed for use in human nutrition by tissuespecific reduction of toxic gossypol［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103(48):18054-18059.

［34］Eady C C， Kamoi T， Kato M，et al.Silencing onion lachrymatory factor synthase causes a significant change in the sulfur secondary metabolite profile ［J］.Plant Physiology，2008，147(4):2096-2106.

［35］Lewis R S，Jack A M，Morris J W，et al.RNA interference(RNAi)‐induced suppression of nicotine demethylase activity reduces levels of a key carcinogen in cured tobacco leaves ［J］.Plant Biotechnology Journal，2008，6(4):346-354.

［36］Muir S R，Collins G J，Robinson S，et al.Overexpression of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit containing increased levels of flavonols ［J］.Nature Biotechnology，2001，19(5):470-474.

［37］Nishihara M， Nakatsuka T， Yamamura S. Flavonoid components and flower color change in transgenic tobacco plants by suppression of chalcone isomerase gene ［J］.FEBS Letters，2005，579(27):6074-6078.

［38］Shoji K，Momonoi K，Tsuji T.Alternative expression of vacuolar iron transporter and ferritin genes leads to blue/purple coloration of flowers in tulip cv.‘Murasakizuisho’［J］.Plant and Cell Physiology，2010，51(2):215-224.

［39］Dexter R，Qualley A，Kish C M，et al.Characterization of a petunia acetyltransferase involved in the biosynthesis of the floral volatile isoeugenol［J］.The Plant Journal，2007，49(2):265-275.

［40］Bapat V A，Trivedi P K，Ghosh A，et al.Ripening of fleshy fruit:molecularinsightand the role ofethylene ［J］.Biotechnology Advances，2010，28(1):94-107.

［41］Xiong A S，Yao Q H，Peng R H，et al.Different effects on ACC oxidase gene silencing triggered by RNA interference in transgenic tomato ［J］.Plant Cell Reports，2005，23(9):639-646.

［42］陳銀華，歐陽波，李漢霞，等.番茄 ACO基因的克隆及其RNAi對乙烯釋放的抑制［J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報，2007，15(3):464-468.

［43］Coetzer C，Corsini D，Love S，et al.Control of enzymatic browning in potato(Solanum tuberosum L.)by sense and antisense RNA from tomato polyphenol oxidase［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(2):652-657.

［44］De Jong M，Wolters‐ Arts M，F(xiàn)eron R，et al.The Solanum lycopersicum auxin response factor 7(SlARF7)regulates auxin signaling during tomato fruit set and development［J］.The Plant Journal，2009，57(1):160-170.

［45］Molesini B，Rotino G L，Spena A，et al.Expression profile analysis of early fruit development in iaaM-parthenocarpic tomato plants ［J］.BMC Research Notes，2009，2(1):143.

［46］Wang Y，Kheir M M，Chai Y，et al.Comprehensive study in the inhibitory effect of berberine on gene transcription，including TATA box ［J］.PloS One，2011，6(8):e23495.

［47］Kamachi S，Mochizuki A，Nishiguchi M，et al.Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing ［J］.Plant Cell Reports，2007，26(8):1283-1288.

［48］Shimizu T，Yoshii M，Wei T，et al.Silencing by RNAi of the gene for Pns12，a viroplasm matrix protein of Rice dwarf virus，results in strong resistance of transgenic rice plants to the virus［J］.Plant Biotechnology Journal，2009，7(1):24-32.

［49］Zhang X，Sato S，Ye X，et al.Robust RNAi-based resistance to mixed infection of three viruses in soybean plants expressing separate shorthairpins from a single transgene ［J］.Phytopathology，2011，101(11):1264-1269.

［50］Zhou Y，Yuan Y，Yuan F，et al.RNAi-directed downregulation of RSV results in increased resistance in rice(Oryza sativa L.)［J］.Biotechnology Letters，2012，34(5):965-972.

［51］Thao N P，Chen L，Nakashima A，et al.RAR1 and HSP90 form a complex with Rac/Rop GTPase and function in innateimmune responses in rice ［J］.The Plant Cell Online，2007，19(12):4035-4045.

［52］Sindhu A S，Maier T R，Mitchum M G，et al.Effective and specificin planta RNAiin cystnematodes:expression interference of four parasitism genes reduces parasitic success［J］.Journal of Experimental Botany，2009，60(1):315-324.

［53］Ibrahim H M M，Alkharouf N W，Meyer S L F，et al.Posttranscriptional gene silencing of root-knot nematode in transformed soybean roots ［J］.Experimental Parasitology，2011，127(1):90-99.

［54］Matsunaga Y，Kawano K，Iwasaki T，et al.RNA interferencemediated growth control of the southern root-knot nematode Meloidogyne incognita ［J］.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2011，76(2):378-380.

［55］Huvenne H，Smagghe G.Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control:a review ［J］.Journal of Insect Physiology，2010，56(3):227-235.

［56］Gordon K H J，Waterhouse P M.RNAi for insect-proof plants［J］.Nature Biotechnology，2007，25(11):1231-1232.

［57］Price D R G，Gatehouse J A.RNAi-mediated crop protection against insects ［J］.Trends in Biotechnology，2008，26(7):393-400.

［58］Mao Y B，Cai W J，Wang J W，et al.Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol［J］.Nature Biotechnology，2007，25(11):1307-1313.

［59］Zha W，Peng X，Chen R，et al.Knockdown of midgut genes by dsRNA-transgenic plant-mediated RNA interferencein the hemipteran insect Nilaparvata lugens［J］.PLoS One，2011，6(5):e20504.

［60］Tabashnik B E，Gassmann A J，Crowder D W，et al.Insect resistance to Bt crops:evidence versus theory ［J］.Nature Biotechnology，2008，26(2):199-202.

［61］Ma L，Reinhardt F，Pan E，et al.Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model［J］.Nature Biotechnology，2010，28(4):341-347.

［62］Katoch R，Thakur N.Advances in RNA interference technology and its impact on nutritional improvement，disease and insect control in plants ［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology，2013，169(5):1579-1605.