剛地弓形蟲類枯草桿菌蛋白酶的研究進展

鄭 斌，尹志奎

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii, Tg)為專性細胞內(nèi)寄生原蟲，可主動侵入多種動物的有核細胞，導致弓形蟲感染或人獸共患弓形蟲病。對于美國和法國來說，弓形蟲已成為繼沙門菌(Salmonella)和李斯特菌(Listeria)后的第三大食源性致死性病原體[1]。

微線體蛋白(microneme proteins, MICs)[2]、棒狀體蛋白(rhoptry proteins, ROPs)[3]及致密顆粒蛋白(dense granules proteins, GRAs)[4]等多種蛋白都參與了弓形蟲粘附、入侵和發(fā)育的過程。其中大多數(shù)蛋白必需經(jīng)蛋白酶修飾或加工后，功能域展現(xiàn)或活性位點形成，蛋白才得以發(fā)揮其功用。類枯草桿菌蛋白酶(subtilisin-like protease, SUB)就是其中的蛋白酶之一，屬于絲氨酸蛋白酶家族的一種。最早發(fā)現(xiàn)的頂復門寄生蟲(弓形蟲、瘧原蟲和隱孢子蟲等)的SUB為惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum, Pf)的PfSUB1 和 PfSUB2[5-6]。PfSUB1有多個作用底物，是惡性瘧的必需蛋白酶，也是一個潛在的抗瘧藥物靶點[7-10]。PfSUB2是一個促進惡性瘧裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1, MSP-1)成熟的成熟酶[6]。SUB在頂復門寄生蟲的生物學中發(fā)揮著重要作用[11-12]。

1 剛地弓形蟲類枯草桿菌蛋白酶1(TgSUB1)

1.1蛋白結(jié)構(gòu)與特性

1.1.1TgSUB1的結(jié)構(gòu) Miller等[13]用PfSUB1(GenBank CAA05261)的催化區(qū)域序列[5]對弓形蟲EST文庫(ParaDB.cis.upenn.edu/toxo/index.html)進行BLAST和模序搜索，得到弓形蟲的相似DNA片段TgESTzy93h10.r1。設(shè)計引物，從弓形蟲RH株的λZAPII cDNA文庫中擴增出2 241 bp片段，但未包含起始密碼。利用5′ RACE(Rapid amplification of cDNA ends)擴增全長基因，命名為TgSUB1。根據(jù)基因的開放讀碼框(open reading frame, ORF)預測TgSUB1蛋白包含信號肽(signal peptide)、prodomain、催化區(qū)(catalytic domain)和富含脯氨酸(proline-rich)的C端。

TgSUB1(GenBank AY043483)蛋白含795個氨基酸殘基(amino acid residue, aa)，分子量84 916 Da，等電點為5.15。在第23aa Gly(Gly23)后有一個預測的信號肽酶酶切位點；氨基酸序列中有與其它生物SUB相似的催化三聯(lián)征Asp259、His315和Ser490及oxyanion hole residue Asn407；C端為富含脯氨酸序列TPP(S/C)APSP(P/S)P(P/R)。新孢子蟲(Neosporacaninum, Nc)的SUB1(NcSUB1, GenBank AAF04257)也含有此序列，但兩者在基本序列和重復片段上有明顯差異[14]。無跨膜區(qū)；在Ser769處有一潛在的糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol, GPI)錨著位點。與其它生物的SUB相比，TgSUB1與NcSUB1最相似，相似率達66%，同PfSUB1、PfSUB2 和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的BPN′相似率分別為40%、32%和33%。催化區(qū)域的氨基酸高度保守。

1.1.2TgSUB1定位于微線體 利用PfSUB1抗血清(能識別TgSUB1)對TgSUB1進行免疫熒光定位，結(jié)果顯示熒光標簽位于蟲體的一極；免疫電鏡下TgSUB1和MIC2共定位于微線體[13]。TgSUB1與MIC相似，以鈣離子依賴的方式從蟲體的微線體分泌。

Binder等[15]分別采用GRA1、ROP1和微線體蛋白2相關(guān)蛋白(MIC2 associated protein, M2AP)的啟動子表達TgSUB1，Western blot結(jié)果表明GRA1、ROP1啟動子啟動下TgSUB1有較高的表達水平；免疫熒光定位顯示GRA1啟動子下表達的TgSUB1定位于納蟲泡(parasitophorous vacuole, PV)和蟲體表面；ROP1啟動子下TgSUB1一部分定位于微線體，一部分可達蟲體表面；M2AP啟動子下TgSUB1定位于微線體。該結(jié)果提示TgSUB1定位于微線體是啟動子特異性的。

將血凝素(hemagglutinin, HA)標簽插入TgSUB1 prodomain基因的不同區(qū)域，誘導表達蛋白。結(jié)果顯示大部分TgSUB1產(chǎn)物被正確加工為小分子形式，且定位于微線體；當HA標簽插入prodomain區(qū)域使其加工過程不完全時，則TgSUB1不能有效的定位于微線體，大量堆積于分泌途徑上。由此判斷TgSUB1 prodomain的加工對于TgSUB1的定位非常重要[15]。

為確定TgSUB1的不同區(qū)域?qū)υ摰鞍锥ㄎ坏挠绊?，Binder等[15]構(gòu)建了前肽(propeptide)、催化區(qū)域、富含脯氨酸區(qū)域和GPI anchor分別缺失的蟲株。免疫熒光定位分別顯示催化區(qū)域、富含脯氨酸區(qū)域和GPI anchor的缺失并不影響TgSUB1定位于微線體，而前肽缺失株的TgSUB1則滯留于蟲體胞核的周圍，因此TgSUB1前肽對于TgSUB1在微線體的定位是必須的。

將TgSUB1前肽序列與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、表面蛋白1(surface antigen 1, SAG1)分別構(gòu)建異構(gòu)重組體，免疫熒光定位顯示GFP、SAG1均可定位于微線體，提示前肽序列中可能含有微線體定位信號肽；將僅含前肽序列的肽段免疫熒光定位，結(jié)果顯示該前肽滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并未到達微線體，提示前肽序列的氨基酸的折疊信息對于前肽功能是必須的[15]。

1.1.3TgSUB1通過GPI錨著與蟲體胞膜連接 氨基酸序列分析顯示TgSUB1有一個GPI錨著的加入位點[13]。Binder等[15]用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(phosphatidylinositol-specific phospholipase C, PI-PLC)處理蟲體，裂解液經(jīng)Triton X-114抽提，TgSUB1產(chǎn)物出現(xiàn)在水相部分，提示TgSUB1的GPI部分已被PI-PLC切去，因為其余部分為水溶性的，因此TgSUB1產(chǎn)物在水相部分出現(xiàn)。

含3H的氨基乙醇(ethanolamine)和軟脂酸酯(palmitate)可以標記GPI錨著蛋白SAG1、SAG3和SAG4，其中3H氨基乙醇是通過GPI anchor來標記蛋白，而軟脂酸酯則通過硫酯(thioester)的聯(lián)接來標記蛋白。PfSUB1抗體識別的免疫共沉淀產(chǎn)物中的TgSUB1能被3H的氨基乙醇和軟脂酸酯標記，提示TgSUB1通過GPI錨著與蟲體胞膜連接。

1.2TgSUB1的功能

1.2.1TgSUB1對多種功能蛋白的酶解加工作用 Miller等[13]的研究發(fā)現(xiàn)TgSUB1連續(xù)被加工，從120 kDa到90 kDa、82 kDa至70 kDa、47 kDa、直至44 kDa蛋白片段，絲氨酸蛋白酶抑制劑brefeldin A可阻止TgSUB1的第二次加工(由90 kDa到82 kDa)，提示TgSUB1可能具有自身修飾功能。

在正常情況下，M2AP被加工為M2AP1～4 4個蛋白片段[16]；MIC4(72 kDa)的N端先被剪切產(chǎn)生一個70 kDa的分子，然后其C端被加工產(chǎn)生50 kDa 和15 kDa的產(chǎn)物[16-18]。在SUB1缺失(△sub1)的弓形蟲株分泌產(chǎn)物中檢測不到 MIC4 50 kDa和M2AP1～4。同樣，野生株的MIC2在正常情況下其N端被切去一個5 kDa的蛋白片段，但△sub1蟲株的MIC2的分子量較大，提示其未被加工[19]。

為進一步分析TgSUB1的潛在作用底物，Lagal等[19]用雙向差異凝膠電泳(two-dimensional differential gel electrophoresis, 2D-DIGE)對△sub1蟲株排泄分泌抗原(excreted-secreted antigen, ESA)進行蛋白組學分析，結(jié)果顯示：1)未觀察到TgSUB1的80 kDa、70 kDa、40 kDa及TgSUB1 prodomain蛋白片段；2)MIC2 95～90 kDa蛋白片段、M2AP1～4蛋白片段、MIC4 50 kDa和15 kDa產(chǎn)物的量減少；3)M2AP成熟體和MIC4 72 kDa precursor的量增加；4)MIC1、MIC3和GRA7等蛋白的豐度增加。這些結(jié)果提示△sub1蟲株中多種蛋白的加工與野生株不同。

眾多研究表明弓形蟲的出胞(egress)過程不同于蟲體入胞過程，發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白也不同[20]。Roiko 等[21-22]認為TgSUB1有可能參與蟲體出胞過程中蛋白的酶解加工。

1.2.2TgSUB1與蟲體的粘附、入侵及滑移運動相關(guān) 由于弓形蟲蟲體表面蛋白水解加工關(guān)系到MICs的激活、蟲體的粘附及入侵，因此Lagal等[19]分析了不同弓形蟲株粘附、入侵宿主細胞的能力。實驗結(jié)果顯示△sub1蟲株的粘附效率下降了30～40%，入侵效率(和宿主細胞共孵育15 min)下降了45～60%。當入侵時間的標準向后延遲設(shè)定為1 h時，△sub1蟲株的入侵程度與對照蟲株相當，提示△sub1蟲株對宿主細胞的入侵為延緩入侵，這種現(xiàn)象在M2AP缺陷株的入侵中同樣存在[23]。因此，TgSUB1的缺失削弱了速殖子的粘附和入侵效率[19]。

弓形蟲速殖子有3種運動方式：螺旋運動(helical)、環(huán)狀運動(circular)及快速轉(zhuǎn)動(twirling)[24]。將△sub1蟲株滴加在FBS包被的蓋玻片上，活體視頻顯微鏡(live video microscopy)下未能觀察到其滑移運動蹤跡，而補充了全長SUB1的△sub1蟲株則可呈現(xiàn)出相應的蹤跡，提示△sub1蟲株的滑移運動(gliding motility)存在缺陷。

1.2.3TgSUB1與蟲體的毒力相關(guān) 將10-1 000個蟲株(△sub1株和對照株)由腹腔途徑感染小鼠，小鼠死亡的時間無明顯差異。250個蟲體由靜脈途徑感染小鼠，對照株感染小鼠的死亡時間為10 d，而△sub1株感染小鼠的死亡時間為14～15 d，提示在小鼠動物模型上，TgSUB1的表達對于弓形蟲毒力是必須的[19]。

1.2.4TgSUB1的活性及酶解加工特性受TgMIC5的抑制 Brydges等[25]發(fā)現(xiàn)TgMIC5可抑制TgSUB1的活性，推測其機制為：1)TgMIC5直接與TgSUB1聯(lián)接，并占據(jù)其活性位點；2)TgMIC5與TgSUB1的作用底物相連，從而保護底物免受TgSUB1的過度作用(因為TgMIC5與任何蛋白抑制劑無氨基酸序列相似性)。Saouros等[1]利用核磁共振分光術(shù)(nuclear magnetic resonance spectroscopy)發(fā)現(xiàn)TgMIC5的三維結(jié)構(gòu)與TgSUB1 prodomain相似，其C端彈性肽可插入TgSUB1的活性位點，從而抑制該蛋白的活性。不僅TgSUB1的活性受MIC5抑制，TgSUB1自身的修飾及TgSUB1對TgMIC4、TgMIC2、TgM2AP和穿孔素樣蛋白1(perforin-like protein 1, PLP1)的加工也被抑制。也正是由于與膜錨著蛋白TgSUB1的直接相互作用，TgMIC5才得以滯留于蟲體胞膜上。

1.2.5TgSUB1為弓形蟲病診斷抗原的候選分子 Hruzik等[26]利用雙向電泳對弓形蟲裂解液進行篩選，質(zhì)譜分析差異位點，結(jié)果提示TgSUB1為一潛在的急性弓形蟲病診斷抗原。在體外利用原核表達系統(tǒng)制備TgSUB1 C端蛋白片段，約24.7 kDa，以空質(zhì)粒菌做對照，分別與29份未感染血清、23份急性弓形蟲病患者血清和28份慢性或隱性感染者血清進行線性點雜交實驗(Line blot assay)，結(jié)果顯示TgSUB1可以很好地與急性感染血清中的IgA、IgM和IgG反應，提示TgSUB1為弓形蟲病診斷抗原的候選分子之一。

2 剛地弓形蟲類枯草桿菌蛋白酶2(TgSUB2)

2.1蛋白結(jié)構(gòu)與特性

2.1.1TgSUB2的結(jié)構(gòu) Miller等[27]以已知的惡性瘧原蟲的PfSUB1設(shè)計同源引物，PCR擴增TgSUB2。TgSUB2(GenBank AF420596)基因ORF全長3 903bp，1 300個aa，包含有信號肽、跨膜區(qū)和催化三聯(lián)征D783、H836、S999和 oxyanion hole N931。TgSUB2和其它SUB有300個aa(包括蛋白催化區(qū)域)非常相似。在催化區(qū)域，TgSUB2與PfSUB2的相似度較高(35%)，與TgSUB1、NcSUB1有30%相似。TgSUB2有一個鈣連接環(huán)(calcium-binding loop)N849-V853，提示該蛋白并非蛋白酶K家族成員。TgSUB2為I 型跨膜蛋白。

2.1.2TgSUB2與TgSUB1為兩個不同的蛋白 免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)能識別TgSUB1的PfSUB1抗體不能與TgSUB2的沉淀物發(fā)生明顯反應，僅在90 kDa處有弱的蛋白條帶。提示TgSUB1和TgSUB2為弓形蟲速殖子的兩個截然不同的蛋白，且兩蛋白僅有很小的交叉反應性。

2.1.3TgSUB2為蟲體的必須蛋白 為觀察TgSUB2基因斷裂后對弓形蟲入侵的影響，Miller等[27]試圖制備TgSUB2基因斷裂株，無論是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenical acetyl transferase, CAT)篩選標記還是次黃嘌呤-黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine xanthine guanine phosphoribosyl transferase, HXGPRT)體系，200多個克隆均未得到TgSUB2基因斷裂株，提示TgSUB2基因為速殖子的必需基因，一旦基因斷裂，TgSUB2蛋白缺失，蟲體不能存活。

2.1.4TgSUB2定位于棒狀體 Miller等[27]用TgSUB2抗體Western blot分析弓形蟲速殖子ESA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在微線體及致密顆粒胞器分泌的蛋白中檢測不到TgSUB2。免疫電鏡下兔源性抗體識別的TgSUB2分布于棒狀體的球部，與小鼠源性單克隆抗體Tg49識別的TgROP1共定位于棒狀體。與PfSUB2不同，PfSUB2定位于裂殖子(merozoite)的致密顆粒胞器[6]。

2.2TgSUB2的功能

2.2.1TgSUB2對其自身、TgROP1進行加工 在TgSUB2 C端加一個HA標簽，E686突變?yōu)镽，S999突變?yōu)锳，分別制備TgSUB2-HA、TgSUB2-HA E686R和TgSUB2-HA S999A重組體，轉(zhuǎn)染入表達系統(tǒng)，TgSUB2抗體和HA抗體Western blot分析表達產(chǎn)物。在TgSUB2-HA的表達產(chǎn)物中可以檢測到三個蛋白條帶：140 kDa、90 kDa和85 kDa，而在TgSUB2-HA E686R和TgSUB2-HA S999A的表達產(chǎn)物中，TgSUB2抗體可以檢測到三個蛋白條帶，HA抗體只檢測到兩個蛋白條帶：140 kDa和85 kDa，該結(jié)果提示TgSUB2對其自身有加工作用，且該作用發(fā)生在蛋白的N端，作用位點為E686；S999為TgSUB2的活性位點之一，一旦突變，TgSUB2的活性受到影響[27]。

瘧原蟲ROP多組裝為大的復合體，才能被正確運輸至棒狀體胞器。弓形蟲的多數(shù)ROP也經(jīng)歷相同的加工過程。TgROP1的剪切位點E83突變后，TgROP1的加工受到抑制。分析TgSUB2和TgROP1的蛋白序列，兩者有相似的剪切位點，提示TgSUB2有可能參與TgROP1的加工[27]。

2.2.2TgSUB2與TgROP1相聯(lián)接 TgSUB2可以和弓形蟲裂解液中的部分TgROP1共同出現(xiàn)在免疫共沉淀產(chǎn)物中，提示TgSUB2和TgROP1相聯(lián)接[27]。而且，與TgSUB2聯(lián)接的是TgROP1的成熟體，非TgROP1前體，該發(fā)現(xiàn)支持TgSUB2對TgROP1有加工作用的推測。Kim等[28]認為既然TgSUB2對TgROP1加工后，能使其由前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒祗w，則TgSUB2為TgROP1的成熟酶(maturase)。與ROP2、ROP4不同，TgSUB2不具有棒狀體定向序列YXXF或NYXP，該蛋白之所以定位于棒狀體，可能與它和ROP1的聯(lián)接作用相關(guān)。

3 結(jié) 語

TgSUB1和TgSUB2參與弓形蟲的粘附、入侵和運動，并影響蟲株的毒力；PfSUB1、PfSUB2和PfSUB3[29]在蟲體入侵及發(fā)育過程中發(fā)揮作用，且PfSUB1還是一個潛在的抗瘧藥物靶點；微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum, Cp)的SUB1在蟲體感染細胞時發(fā)揮作用，也有可能作為一個潛在的藥物靶點[30]。隨著頂復門寄生蟲SUB的廣泛深入研究，有助于發(fā)現(xiàn)更多TgSUB及它們在弓形蟲生物學中的更多作用，有可能發(fā)現(xiàn)合適的藥物靶點，從而有效預防弓形蟲感染和弓形蟲病。

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