胎兒彎曲菌的感染現(xiàn)狀、檢測方法和分子分型的研究進展

侯水平，陳守義

彎曲菌屬(Campylobacterspp)是一類革蘭染色陰性，氧化酶陽性，呈逗點、S形或螺旋狀彎曲，單極或雙極鞭毛、動力活潑的嗜微需氧菌。彎曲菌常定居在野生動物、家禽、家畜及寵物的腸道內，通過“糞-口”途徑的方式感染人類。引起以急性腹瀉為主要癥狀的感染性疾病，稱之為彎曲菌病[1]。彎曲菌屬包括17個種和6個亞種[2]，其中空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、海鷗彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌是發(fā)達國家急性腹瀉的常見致病菌[3]；而胎兒彎曲菌常導致人類腸外感染，如菌血癥、腦膜炎、關節(jié)炎、蜂窩組織炎、動脈瘤感染等[4-6]。胎兒彎曲菌可分為胎兒亞種和性病亞種，性病亞種常導致牛羊不育、流產和生殖道炎癥[7]； 胎兒亞種也可導致散在的牛羊早產、流產，但與性病亞種相比，癥狀較輕[8]。

可能是因培養(yǎng)條件及檢測方法所限，國內胎兒彎曲菌感染病例的報道極少，僅有3篇文獻報道[5,9-10]。國外文獻報道相對較多，集中于關節(jié)炎、腦膜炎、菌血癥、腹膜炎和心內膜炎等[6,11-18]，大多數(shù)都患有基礎性疾病如：腫瘤、白血病，肺氣腫等免疫低下人群。但也有報道美國紐約一名28歲青年男子以及另一名20歲青年男子因胎兒彎曲菌感染引起敗血癥[19-20]。胎兒彎曲菌常導致牛羊疾病，給牛羊的養(yǎng)殖造成重大損失。新疆農業(yè)大學趙紅瓊從患有子宮內膜炎的25頭奶牛的分泌物中分離出了5株胎兒彎曲菌[21]，黑龍江八一農墾醫(yī)院的朱戰(zhàn)波等對流產的奶牛的子宮內容物進行檢查，也分離出了胎兒彎曲菌。臺灣一學者從179份爬行動物糞便樣本中檢出12株胎兒彎曲菌(陽性率6.7%)[22]。由于胎兒彎曲菌感染牲畜的癥狀跟布魯菌感染的癥狀很相似，因此常常因找不出病原體而受到忽視[23]。

由于胎兒彎曲菌是嗜微需氧菌，最適生長條件為體積比為5%O210%C0285%N2的氣體環(huán)境，在普通條件下無法生長。而且其生長緩慢，在培養(yǎng)基上需要2～3 d。對胎兒彎曲菌的檢測方法，從標準來看目前我國僅有國標《GB/T18653-2002》針對綿羊、牛、冷凍精液中胎兒彎曲菌的檢測方法。這種傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)方法需要經(jīng)增菌、劃線分離、生化鑒定3個步驟，至少需要9 d。此標準中有一個生化鑒定試驗：42 ℃生長試驗，胎兒彎曲菌在42 ℃無法生長。但是國外學者Harvey和Greenwood發(fā)現(xiàn)，有14株胎兒彎曲菌均能在42 ℃生長[24]。同時學者Frank Schulze對分別對胎兒亞種和性病亞種的研究中發(fā)現(xiàn)22株胎兒亞種有18株(81.8%)能在42 ℃生長，81株性病亞種中有8株(9.9%)能在42 ℃生長[25]。因此42 ℃生長試驗不能作為胎兒彎曲菌的鑒定標準。目前，自動化的微生物檢測設備如生物梅里埃公司VITEK儀，其配套有GN卡、GP卡、NH卡，但是尚沒有針對微需氧菌的鑒定卡。僅有手工操作鑒定彎曲菌的試劑條 APIcampy，這種檢測試劑條只能鑒定胎兒亞種，不能鑒定性病亞種。

由于傳統(tǒng)的鑒定方法時間較長，難以適應現(xiàn)代診斷和研究需要，并且隨著核酸檢測技術的發(fā)展，越來越多的研究者將這項技術應用到診斷領域。一是針對16s RNA序列:南方醫(yī)科大學附屬小欖醫(yī)院的黃健云將分離的2株未知細菌測其16s RNA序列，并將其序列在NCBI genbank數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)這兩株的序列與胎兒彎曲菌胎兒亞種的序列完全一致[10]。K. BLOM針對特異性的部分16s RNA基因設計了PCR方法，并用18株胎兒彎曲菌菌株和30株彎曲菌屬的其他種、亞種進行了驗證，發(fā)現(xiàn)有很好的特異性[26〗。因此這種方法利用了序列的每個堿基信息，因此鑒定結果可靠性強。二是針對某一個毒力基因或特異性的一段序列:國內學者趙海玲等通過熒光PCR方法檢測胎兒彎曲菌的sapA毒力基因，靈敏度高，特異性強[27]，但是這種方法不能區(qū)別胎兒亞種和性病亞種。同時，也有專門針對某一亞種檢測的研究。如專門針對胎兒亞種的sapB2基因并且可以同時檢測彎曲菌屬其他種空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、海鷗彎曲菌的多重PCR方法；專門針對性病亞種的環(huán)介導等溫PCR(LAMP)方法和熒光PCR方法[28-29]，可以很好的將性病亞種和胎兒亞種以及其他彎曲菌區(qū)別。這兩種方法只針對某一亞種，在重點關注某一亞種的時候具有重要作用。另外，也有同時檢測兩種亞種進行了探索。Frank Schulze設計了兩對引物，第一對引物(MG3F和MG4R)針對胎兒彎曲菌，第二對引物(VENSF和VENSR)針對性病亞種，對103株胎兒彎曲菌(81株性病亞種和22株胎兒亞種)進行了生化表型和多重PCR擴增比較，發(fā)現(xiàn)PCR擴增結果與生化表型完全符合[25]。這種多重PCR方法可以區(qū)別兩種亞種，但是需要瓊脂糖凝膠電泳和成像分析。

由于胎兒彎曲菌可從蹄類動物(牛、羊)、豬、鳥、爬行動物中檢出[18]，因此對人體的感染是否與接觸或食用這些動物有關，目前尚不明確。紐約大學醫(yī)學院Zheng-Chao Tu從一名白血病患者血液中分離的菌株通過基因分型分析，發(fā)現(xiàn)來源于爬行類動物[30]。美國紐約一名青年男子因胎兒彎曲菌感染引起敗血癥懷疑由于食用了阿拉伯的生茶葉[19]。且多名菌血癥的患者患病前均有禽鳥、生肉的接觸史[9,19,31-32]。因此，需要從分子原理掌握這些分離株的基因多態(tài)性，以滿足流行病學溯源以及分子流行病學研究。

對胎兒彎曲菌的基因分型，有如下幾種方法：(1)隨機擴增多態(tài)性分析(RAPD),這種分型方法的基本原理是基因組DNA在比較低的退火溫度下，一條或多條隨機引物與基因組DNA模板上與之配對的位點結合，從而擴增出不同大小的多個片段，擴增片段按照大小在凝膠上呈現(xiàn)不同的指紋圖譜，通過圖譜研究其同源性和多態(tài)性[33]。紐約大學醫(yī)學院zengchao tu 把分離的19株胎兒彎曲菌用10條隨機引物擴增，可以區(qū)別哺乳動物來源的菌株和爬行動物來源的菌株[34]。5條隨機引物能夠區(qū)別胎兒亞種和性病亞種。但是這種方法影響因素較多，重復性不好，不便于不用實驗室之間的比較。(2)擴增片段長度多態(tài)性分析(AFLP),這種分型方法的原理是利用不同物種基因組DNA長度不同，經(jīng)限制性內切酶酶切成不同大小的限制性片段，使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴增反應的模板，用含有選擇性堿基的引物對模板DNA進行擴增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴增片段的特殊性，只有那些限制性位點側翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴增。從而保證PCR反應產物可經(jīng)變性聚丙烯酸胺凝膠電泳來分辨。AFLP揭示的DNA多態(tài)性是酶切位點和其后的選擇性堿基變異。學者Wagenaar J A 將胎兒彎曲菌用生化分型、pcr分型和AFLP進行比較，發(fā)現(xiàn)AFLP能將所有菌株區(qū)分胎兒亞種和性病亞種[35]。AFLP結合了RFLP和PCR的優(yōu)點，但是操作繁瑣。(3)脈沖場凝膠電泳(PFGE),其基本原理是對全基因組DNA用稀有位點的酶切后，通過脈沖場凝膠電泳根據(jù)片段大小而分離出不同位置的條帶。多條條帶組成的圖譜則為該種基因型。這種分型方法克服了普通電泳不能分離大片段的不足，可以分離幾KB甚至幾MB的分子。學者Marcel A.P. van Bergen 對21株胎兒亞種和2株性病亞種進行PFGE分型，發(fā)現(xiàn)可以很好的識別爆發(fā)株、散發(fā)株[36]。這種分型方法重復性好、分辨率高、結果穩(wěn)定、易于標準化。PFGE對操作者技能以及經(jīng)驗要求較高，過程較為繁瑣。(4)多位點序列分析(MLST),分型原理是選擇某一菌屬的一組管家基因(一般為7個及以上)作為分型目標基因，分別設計引物擴增400bp至500bp的基因序列進行測序，根據(jù)菌株每個基因的序列信息分配等位基因序號，把該菌株所有基因的等位基因序號合并在一起組成一個等位基因譜，并給這個等位基因譜分配一個唯一的編號作為該分離株的核酸型或序列型(sequence type, ST)。這種基因分型方法分辨力強，可以媲美PFGE,同時便于在不同實驗室之間進行比較和在數(shù)據(jù)庫中檢索。這種分型方法已用于多種原核生物、真核生物的分型、進化分析上[37]。目前，牛津大學已建立胎兒彎曲菌的數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/cfetus/)，并確定了標準操作流程，供世界范圍內學者進行檢索、比對、存儲。這種分型方法充分利用管家基因上的所有序列信息，同時兼顧有重復性好和易于標準化的優(yōu)點，已廣泛應用于分子流行病學研究，隨著測序技術的發(fā)展和測序成本的降低，這項技術具有很好的應用前景。

現(xiàn)在隨著家庭所養(yǎng)寵物的增加、人與動物的親近以及人類食用多種生肉制品，都大大增加了人感染人獸共患病的風險。而由于苛養(yǎng)細菌引起的不明原因疾病，往往由于檢驗技術低下、診斷不明確導致誤診或延誤治療。因此探索胎兒彎曲菌的快速檢測方法以及對不同來源的菌株進行親緣性分析，識別爆發(fā)流行，為疾病的診斷、控制以及胎兒彎曲菌病的分子流行病學研究具有十分重要的意義。

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