腸道病毒71型研究進(jìn)展

翁育偉(綜述)，嚴(yán)延生(審校)

腸道病毒71型(enterovirus 71, EV71)是引起兒童手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)的主要病原體，病毒感染后的臨床表現(xiàn)包括無癥狀感染以及以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為特征的HFMD，少數(shù)患者可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心肌炎等，個別患者病情進(jìn)展迅速，可導(dǎo)致死亡。在HFMD患者中，EV71感染是造成重癥和死亡的主要危險因素之一。EV71最早發(fā)現(xiàn)于1969年，上世紀(jì)70-80年代，該病毒主要以散發(fā)形式流行于美洲及歐洲等國家，歐洲個別國家曾有暴發(fā)流行。1997年后EV71開始在亞洲持續(xù)發(fā)生暴發(fā)流行并不斷擴(kuò)散，目前已經(jīng)成為亞太地區(qū)的重要公共衛(wèi)生問題，對本地區(qū)兒童健康造成嚴(yán)重影響。為應(yīng)對和控制EV71的流行，近年來各國在EV71的防控上投入了大量的資源并取得了顯著的進(jìn)展。本文就目前在EV71的流行病學(xué)、病毒受體研究、抗病毒治療以及疫苗發(fā)展等方面取得的進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 病毒學(xué)

在病毒分類上，EV71屬于小RNA病毒科(picoraviridae)腸道病毒屬(enterovirusgenus)成員，病毒的形態(tài)為無包膜正二十面體結(jié)構(gòu)，大小約為33-35nm[1]，基因組為一長約7.4 kb的單正鏈RNA分子，其5’末端與病毒的Vpg蛋白共價結(jié)合，形成非帽子結(jié)構(gòu)的5’末端。病毒基因組從5’端到3’端分別為5’ 端非編碼區(qū)、蛋白編碼區(qū)和3’ 端非編碼區(qū)。其中5’端非編碼區(qū)含有控制病毒復(fù)制和蛋白翻譯的重要元件，3’端非編碼區(qū)含有多聚腺苷酸尾，兩者之間具有單一的長的開放閱讀框，編碼病毒多聚蛋白。病毒基因組RNA可以作為mRNA模板，用于病毒多聚蛋白的合成。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始因子與 5’端的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal ribosomal entry site, IRES)結(jié)合，啟動病毒多聚蛋白的翻譯。合成的多聚蛋白在病毒自身蛋白酶(2Apro，3Cpro)的作用下，水解成為4種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-4)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(2A-2C，3A-3D)。VP1-4結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成病毒的基本的衣殼結(jié)構(gòu)單位(protomer)，其中VP1-3暴露于病毒表面，而VP4蛋白則包埋于病毒內(nèi)部。病毒VP1蛋白表面具有重要的細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)[2-3]，以及中和抗體表位[4]。病毒的復(fù)制在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成，在復(fù)制過程中，基因組RNA可作為模板，用于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負(fù)鏈RNA分子，再以負(fù)鏈RNA為模板合成子代RNA?；蚪M復(fù)制完成后，病毒在細(xì)胞內(nèi)完成子代病毒的裝配并以裂解的方式釋放到細(xì)胞外。

2 流行病學(xué)

EV71最早是1969年從美國1例9月齡腦炎兒童病例標(biāo)本中分離[5]。上世紀(jì)70-80年代，EV71僅在歐美、澳大利亞等地流行，除局部暴發(fā)以外，主要以低水平流行。1970年代，歐洲暴發(fā)了兩次大的EV71流行，1975年保加利亞[6]、1978年匈牙利[7]先后暴發(fā)了EV71流行，分別報告705例和1 550例病例，并造成44和47例亡。進(jìn)入90年代后，亞洲成為EV71的主要流行地區(qū)。1997年，馬來西亞的沙撈越地區(qū)暴發(fā)EV71引起的手足口病[8]，報告發(fā)病約13萬例。1998年臺灣暴發(fā)了EV71引起的手足口病大流行[9]，在報告的近13萬病例中，重癥405例，死亡78例。此后EV71即在臺灣長期流行。2010年，新加坡暴發(fā)了該國有史以來最大的手足口病流行，在報告的3 790例病例中有73%的病例由EV71感染造成[10]。在我國，自1998年起就有EV71的流行，但2007年之前僅以散發(fā)為主。2007年山東臨沂[11]和2008年安徽阜陽[12]先后暴發(fā)了以EV71感染為主的手足口病，分別造成14例和23死亡，之后EV71在國內(nèi)開始了持續(xù)的暴發(fā)流行。除了上述國家和地區(qū)外，同期亞洲其它國家也有EV71流行的報道。

EV71主要感染兒童[13]。在早期的EV71感染中，病例的臨床表現(xiàn)主要以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主，如病毒性腦炎、無菌性腦膜炎等。但自1973年日本EV71暴發(fā)流行后，EV71感染的臨床表現(xiàn)開始傾向于皮膚病變，以發(fā)熱以及手、足、口腔粘膜皰疹等為主要臨床表現(xiàn)，即手足口病。但與同樣引起HFMD的其它腸道病毒相比，如CVA16等，EV71感染的臨床癥狀更嚴(yán)重，尤其是在嬰幼兒中[14]，更易導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，死亡率也更高，是造成HFMD患者重癥和死亡的主要危險因素之一。EV71流行有明顯的季節(jié)性特征，其主要流行季節(jié)在夏季，在我國，EV71流行的高峰除了夏季(4-6月)外，南方和中部省份9-10月左右還有一個明顯的次高峰[13]。影響EV71流行的因素包括溫度、濕度以及降雨等氣候條件[13]以及高人口密度[15]等。在感染者個體因素方面，有研究表明白細(xì)胞抗原HLA-A33和EV71的易感性高度相關(guān)，HLA-A33是亞洲人常見的表型，而白種人中少見，這可能是亞洲的EV71流行較歐美嚴(yán)重[16]的原因。

EV71的進(jìn)化[17]導(dǎo)致眾多的基因型(genotype)和基因亞型(sub-genotype)的出現(xiàn)，基于病毒序列分析的分子分型方法[18]已被普遍接受。根據(jù)VP1核苷酸序列的差異，EV71分為A-C等3個基因型[19]。其中，A基因型僅有一個成員即EV71的原型(BrCr)株，而B和C基因型又可進(jìn)一步分為B1-5、C1-5各5種基因亞型。1985年以前發(fā)現(xiàn)的EV71多為B基因型(B1和B2)，C基因型病毒則在1985年之后出現(xiàn)[19]，其中，C3和C5分別局限在韓國和越南[17]。從全球看，目前歐美等國家主要流行C1和C2亞型病毒，而在亞太地區(qū)，則呈現(xiàn)B3-5、C1-2、C4等多種基因亞型病毒共同循環(huán)的局面。在我國，1998年至今主要流行的病毒為C4亞型，但2004年之前以C4b為主，而2004年之后則以C4a為主[20]。在臺灣，1986到2008年期間至少發(fā)生了3次的EV71病毒的基因型轉(zhuǎn)換[22]。病毒基因型的轉(zhuǎn)換有利于病毒逃脫人群免疫壓力，進(jìn)而在人群中擴(kuò)散，因此病毒基因亞型的頻繁轉(zhuǎn)換可能是導(dǎo)致亞太地區(qū)手足口病周期性暴發(fā)的原因[21]。除此以外，病毒之間的重組[23]也使得手足口病的流行和致病性等特征進(jìn)一步復(fù)雜化。

3 病毒受體

EV71可以通過糞-口、呼吸道、接觸等多種途徑傳播。病毒進(jìn)入宿主后，首先在扁桃體、派氏淋巴結(jié)等處進(jìn)行復(fù)制，隨后經(jīng)外周淋巴結(jié)，產(chǎn)生病毒血癥，多數(shù)病例在該時期即可控制病毒在體內(nèi)的進(jìn)一步彌散和臨床進(jìn)展。在病毒感染過程中，病毒與特異性受體的結(jié)合是啟動EV71病毒感染和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的關(guān)鍵步驟。

近幾年，EV71受體的相關(guān)研究取得了重大突破。首先是Yang等的研究[24]表明，EV71受體可能是一類O型鏈接的唾液酸化(sialylated glycan)糖蛋白或糖脂。破壞DLD-1腸道上皮細(xì)胞表面O鏈接的唾液酸化多糖(SA-linked O-glycan)可以抑制EV71病毒的感染，因此作者推測EV71受體可能是一類唾液酸化多糖。但最近的研究表明此類受體可能是一類吸附性受體[25]。

2009年Nishimura等人[3]證實(shí)了P選擇素配體1糖蛋白(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1，CD162)是EV71的一種功能性受體，該受體主要分布在淋巴細(xì)胞表面，其N末端42-61aa是與EV71相互作用的關(guān)鍵部位。EV71病毒與PSGL-1結(jié)合可介導(dǎo)病毒感染。但神經(jīng)細(xì)胞表面普遍缺乏PSGL-1，因此該受體無法介導(dǎo)病毒對神經(jīng)細(xì)胞的感染，同時PSGL-1也僅介導(dǎo)部分基因(亞)型的EV71感染?；谏鲜鲈?，推測可能還有替代途徑支持EV71對神經(jīng)細(xì)胞的感染，以及其它PSGL-1非依賴病毒對宿主細(xì)胞的感染。

清道夫受體B2(Scavenger receptor class B member 2，SCARB2)是一類III型雙跨膜蛋白，主要分布于細(xì)胞的內(nèi)體和溶酶體，同時表達(dá)在多種細(xì)胞的表面。Yamayoshi等的研究[2]證實(shí)了SCARB2是一種EV71的細(xì)胞表面受體，SCARB2可與EV71結(jié)合并介導(dǎo)病毒的感染，與PSGL-1不同，SCARB2可介導(dǎo)所有基因(亞)型病毒感染，同時還介導(dǎo)CVA7、10、14、16的感染。由于SCARB2在各種細(xì)胞表面普遍存在，因此，SCARB2可能是病毒在宿主體內(nèi)播散的重要受體。然而研究表明[2]，盡管感染效率較低，但SCARB2缺失細(xì)胞也能部分支持EV71的感染，這種現(xiàn)象提示SCARB2可能并非介導(dǎo)EV71感染的唯一受體。

膜聯(lián)蛋白II(Annexin II，Anx2)是一種細(xì)胞粘附因子，Yang等的研究[26]表明，Anx2蛋白可與EV71病毒的40-100aa結(jié)合，增強(qiáng)EV71病毒的感染性，表達(dá)Anx2的HepG2細(xì)胞可大幅提高部分基因亞型(C2/C5/B5)EV71的細(xì)胞表面吸附和病毒產(chǎn)量，但Anx2并非EV71感染所必須。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)在機(jī)體抗病毒免疫過程中具有重要的作用，EV71感染DC有利于誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，在病毒感染過程中，DC細(xì)胞的DC-SIGN分子可能也部分發(fā)揮作用[27]。

上述有關(guān)病毒受體的研究成果，為今后EV71的治療和預(yù)防相關(guān)研究提供了重要的基礎(chǔ)，比如建立動物模型[28]、抗病毒藥物的設(shè)計等。然而有研究表明，啟動腸道病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞可能需要多種受體的協(xié)同作用[29]，因此，上述幾種受體真正的生物學(xué)功能、相互之間的關(guān)系以及受體在介導(dǎo)EV71病毒進(jìn)入、感染以及在疾病中的作用等機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 抗病毒治療

目前，臨床上對EV71感染尚缺乏特異性的治療手段，臨床治療仍以對癥、支持治療為主要方法，因此研制特異性抗病毒藥物對EV71感染的治療和預(yù)防控制具有重要意義。目前，針對EV71抗病毒藥物研發(fā)的策略主要集中在阻斷病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞、抑制病毒復(fù)制、阻斷病毒蛋白合成以及調(diào)節(jié)機(jī)體抗病毒免疫等環(huán)節(jié)[30]。

中和抗體在阻斷病毒感染中具有重要的作用，利用滅活病毒或VP1蛋白中和表位多肽制備中和抗體，可有效抑制病毒的感染[31]，因此，抗體藥物具有較好的開發(fā)和應(yīng)用前景。由于目前缺尚乏可供臨床用的特異性抗體藥物，因此臨床上僅能使用丙種球蛋白等非特異性的抗體，用于危重病例的臨床救治[32]。

小分子化合物是目前研究抗病毒藥物的另一個熱點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)有多種小分子化合物具有抗病毒活性但其抗病毒的機(jī)制各異，如pleconaril[30]等小分子化合物可通過結(jié)合VP1蛋白，干擾或阻斷病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合；rupintrivir可通過抑制病毒3Cpro蛋白酶活性[33]阻斷病毒的復(fù)制；DTriP-22則可通過作用于病毒3D蛋白，即病毒RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)抑制病毒的復(fù)制[34]。然而，盡管上述小分子化學(xué)藥物具有一定的抗病毒作用，但也存在一些缺陷，例如并非所有的基因型的EV71病毒對pleconaril都敏感，因此這些化合物藥物的作用機(jī)制、應(yīng)用效果需進(jìn)一步明確。

機(jī)體免疫調(diào)節(jié)是抗EV71治療的另一重要手段。巨噬細(xì)胞具有殺病毒活性，研究表明移植成年鼠巨噬細(xì)胞可以有效抑制EV71在攻毒小鼠內(nèi)的復(fù)制，減輕癥狀并降低死亡率[35]。I型干擾素(IFN)可以有效降低攻毒小鼠的死亡率，其中，IFNα14具有明顯的抗病毒效應(yīng)[36]，這種效應(yīng)可能是IFNα14具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)抗病毒效應(yīng)分子的結(jié)果。上述結(jié)果提示，在EV71的治療中，可能可以通過免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答，從而達(dá)到抗病毒治療效果。

除了上述手段外，RNA干擾、病毒多肽等一些新技術(shù)[37]也為EV71的抗病毒治療提供了新的選擇。盡管EV71的抗病毒治療還有許多問題待解決，但目前許多基礎(chǔ)研究所取得的成果，比如病毒受體的發(fā)現(xiàn)等，將為今后特異性抗病毒治療的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

5 疫 苗

疫苗是預(yù)防傳染病最有效的手段。鑒于EV71感染對兒童健康造成的巨大危害，疫苗研制成為EV71防控研究的首要工作。既往曾嘗試過多種形式的疫苗，包括滅活疫苗[1]、病毒樣顆粒樣疫苗[38]、重組VP1亞單位疫苗[39]、重組VP1 DNA疫苗、VP1多肽疫苗[31]，以及可食性的疫苗(edible Vaccine)[40]等。在上述疫苗類型中，受疫苗相關(guān)法規(guī)以及疫苗生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化等因素的制約，DNA疫苗和可食類疫苗短期內(nèi)難以得到應(yīng)用。EV71減毒活疫苗則因存在毒力返祖的潛力，也受到限制。因此，EV71疫苗研發(fā)主要集中在包括病毒樣顆粒疫苗、重組VP1亞單位疫苗、多肽疫苗以及滅活疫苗在內(nèi)的幾種候選疫苗上，而上述疫苗也是迄今為止FDA批準(zhǔn)的主要病毒疫苗形式。

候選疫苗是否具有應(yīng)用前景，還取決于疫苗的免疫效力。臺灣國立衛(wèi)生研究院疫苗研發(fā)中心利用建立的標(biāo)準(zhǔn)抗原和免疫原性分析方法，比較了幾種主要EV71疫苗的免疫效力[39]，結(jié)果表明，在上述幾種主要的候選疫苗中，其免疫效力為：滅活疫苗>病毒樣顆粒疫苗>重組VP1亞單位疫苗>多肽疫苗。因此，滅活疫苗在幾種候選疫苗中最具應(yīng)用前景。其它如多肽疫苗，雖具有良好的穩(wěn)定性和成本效益，但從免疫效力上看，其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力有限[31]，比如多肽VP1-43(VP1 residues 211-225)僅能誘導(dǎo)低滴度的中和抗體(1/32)，而多肽VP2-28(VP2 residues 136-150)則不能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，因此其發(fā)展和應(yīng)用受到限制。

由于EV71對亞太地區(qū)的危害最為嚴(yán)重，因此目前EV71疫苗的研發(fā)機(jī)構(gòu)主要集中在亞太地區(qū)。鑒于滅活疫苗的應(yīng)用前景[41]，已有中國大陸、臺灣、新加坡共5家生物公司或政府機(jī)構(gòu)正在研制EV71滅活疫苗。由于流行的病毒基因型(或基因亞型)不同，不同的國家在疫苗株的選擇上有所不同，其中中國大陸選擇C4基因型，臺灣選擇B4基因型，而新加坡選擇B3基因型[42]。除病毒型別外，疫苗生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制、免疫效果的評價也是疫苗研制過程中的重要環(huán)節(jié)。目前，包括毒株篩選[43]、抗原含量檢測[44]、中和抗體檢測效果[45]在內(nèi)的質(zhì)量控制方法也已基本建立，應(yīng)用上述標(biāo)準(zhǔn)對國內(nèi)不同疫苗進(jìn)行的免疫效果評價表明[46]，盡管采用的病毒毒株、生產(chǎn)工藝有所差異，但不同疫苗均可產(chǎn)生有效的保護(hù)性抗體。

截止目前，EV71滅活疫苗研制已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，中國大陸的3家疫苗研發(fā)機(jī)構(gòu)研制的EV71疫苗均已經(jīng)完成3期臨床實(shí)驗(yàn)，臺灣和新加坡的兩家公司的疫苗也已經(jīng)完成1期臨床實(shí)驗(yàn)。其中，從國內(nèi)的一家研發(fā)機(jī)構(gòu)(Vigoo)開展的一系列EV71疫苗臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，滅活疫苗具有良好的安全性和免疫原性，疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的中和抗體，對EV71相關(guān)的手足口病的保護(hù)可達(dá)90%(95%CI: 67.1～96.9%)，對EV71相關(guān)的疾病保護(hù)達(dá)80.4% (95%CI 58.2～90.8%)[47]。

預(yù)計在不久的將來，商業(yè)化的EV71疫苗就可投入使用。但疫苗的應(yīng)用依然會面臨一些問題，例如疫苗是否可以提供不同基因型(或亞型)之間的交叉保護(hù)作用[48]等，還有待進(jìn)一步評價。此外，有研究表明，亞中和滴度的抗體可以促進(jìn)EV71病毒感染[49]，因此抗體的ADE(antibody dependent enhancement)效應(yīng)也是今后疫苗使用中必須考慮的問題。由于CVA16病毒也是兒童HFMD的主要病原體之一，而且目前的研究表明，EV71中和抗體尚無法對CVA16提供交叉保護(hù)[50]。因此，有效預(yù)防手足口病，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步研制包含EV71和CVA16等多種病毒成分在內(nèi)的多價疫苗。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu CC, Guo MS, Lin FH, et al. Purification and characterization of enterovirus 71 viral particles produced from Vero cells grown in a serum-free microcarrier bioreactor system[J]. PLoS One, 2011, 6(5): e20005. DOI:10.1371/journal.pone.0020005

[2]Yamayoshi S, YamashitaY, Li JF, et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71[J]. Nat Med, 2009, 15(7): 798-802. DOI:10.1038/nm.1992

[3]Nishimura Y, Shimojima M, Tano Y, et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71[J]. Nat Med, 2009, 15(7): 794-797. DOI:10.1038/nm.1961

[4]Foo DG, Alonso S, Phoon MC, et al. Identification of neutralizing linear epitopes from the VP1 capsid protein of Enterovirus 71 using synthetic peptides[J]. Virus Res, 2007, 125: 61-68. DOI:10.1016/j.virusres.2006.12.005

[5]Schmidt N, Lennette E, Ho H. An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of the central nervous system[J]. J Infect Dis, 1974, 129: 304-309.

[6]Shindarov LM, Chumakov MP, Voroshilova MK, et al. Epidemiological, clinical, and pathomorphological characteristics of epidemic poliomyelitis-like disease caused by enterovirus 71[J]. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol, 1979, 23: 284-295.

[7]Nagy G, Takatsy S, Kukan E, et al. Virological diagnosis of enterovirus type 71 infections: experiences gained during an epidemic of acute CNS diseases in Hungary in 1978[J]. Arch Virol, 1982, 71: 217-227.

[8]Herrero LJ, Lee CS, Hurrelbrink RJ, et al. Molecular epidemiology of enterovirus 71 in peninsular Malaysia, 1997-2000[J]. Arch Virol, 2003, 148: 1369-1385. DOI:10.1007/s00705-003-0100-2

[9]Ho M, Chen ER, Hsu KH, et al. An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan[J]. N Engl J Med, 1999, 341(13):929-935.

[10]Chan KP, Goh KT, Chong CY, et al. Epidemic hand, foot and mouth disease caused by human Enterovirus 71, Singapore[J]. Emerg Infect Dis, 2003, 9(1): 78-85.

[11]Zhang Y, Tan XJ, Wang HY, et al. An outbreak of hand, foot, and mouth disease associated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong, China[J]. J Clin Virol, 2009, 44: 262-267. DOI:10.1016/j.jcv.2009.02.002

[12]Zhang Y, Zhu Z, Yang WZ, et al. An emerging recombinant human enterovirus 71 responsible for the 2008 outbreak of Hand Foot and Mouth Disease in Fuyang city of China[J]. Virol J, 2010, 7: 94. DOI:10.1186/1743-422X-7-94

[13]Wang Y, Feng ZJ, Yang Y, et al. Hand, foot and mouth disease in China: patterns of spread and transmissibility during 2008-2009[J]. Epidemiology, 2011, 22(6): 781-792. DOI:10.1097/EDE.0b013e318231d67a

[14]Chang LL, Lin TY, Huang YC, et al. Comparison of enterovirus 71 and coxsace virus A16 clinical illness during the Taiwan enterovirus epidemic, 1998[J]. Pediatr Infect Dis J, 1999, 18(12): 1094.

[15]Hu M, Li Z, Wang J, et al. Determinants of the incidence of hand, foot and mouth disease in China using geographically weighted regression models[J]. PLoS One, 2012, 7(6): e38978. DOI:10.1371/journal.pone.0038978

[16]Chang LY, Chang IC, Chen WJ, et al. HLA-A33 is associated with susceptibility to enterovirus 71 infection[J]. Pediatrics, 2008, 122(6): 1271.

[17]Tee KK, Lam TT, Chan YF, et al. Evolutionary genetics of human enterovirus 71: origin, population, dynamics, natural selection, and seasonal periodicity of the VP1 gene[J]. J Virol, 2010, 84(7): 3339-3350. DOI:10.1128/JVI.01019-09

[18]Oberste MS, Maher K, Flemister MR, et al. Comparison of classic and molecular approaches for the identification of untypeable enteroviruses[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(3): 1170-1174.

[19]Brown BA, Oberste MS, Alexander JP, et al. Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 1998[J]. J Virol, 1999, 73(12): 9969-9975.

[20]Zhang Y, Wang J, Guo W, et al. Emergence and transmission pathways of rapidly evolving evolutionary branch C4a strains of human enterovirus 71 in the Central Plain of China[J]. PLoS One, 2011, 6(11): e27895. DOI:10.1371/journal.pone.0027895

[21]Huang SW, Hsu YW, Smith DJ, et al. Reemerging of enterovirus 71 in 2008 in Taiwan Dynamics of genetic and antigenic evolution from 1998 to 2008[J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(11): 3653-3662. DOI:10.1128/JCM.00630-09

[22]Wang JR, Tuan YC, Tsai HP, et al. Change of major genotype of enterovirus 71 in outbreaks of Hand-foot-and-mouth disease in Taiwan between 1998 and 2000[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(1): 10-15. DOI:10.1128/JCM.40.1.10-15.2002

[23]Leitch EC, Cabrerizo M, Cardosa J, et al. The association of recombination events in the founding and emergence of subgenogroup evolutionary lineages of human enterovirus 71[J]. J Virol, 2012, 86(5): 2676-2685. DOI:10.1128/JVI.06065-11

[24]Yang B, Chuang H, Yang KD, et al. Sialylated glycans as receptor and inhibitor of enterovirus 71 infection to DLD-1 intestinal cells[J]. Virol J, 2009, 6: 141.DOI:10.1186/1743-422X-6-141

[25]Tan CW, Poh CL, Sam IC, et al. Enterovirus 71 uses cell surface heparan sulfate glycosaminoglycan as an attachment receptor[J]. J Virol, 2013, 87(1): 611-620. DOI:10.1128/JVI.02226-12

[26]Yang SL, Chou YT, Wu CN, et al. Annexin II binds to capsid protein VP1 of enterovirus 71 and enhances viral infectivity[J]. J Virol, 2011, 85(22): 11809-11820. DOI:10.1128/JVI.00297-11

[27]Lin YW, Wang SW, Tung YY, et al. Enterovirus 71 infection of human dendritic cells[J]. Exp Biol Med, 2009, 234: 1166-1173.

[28]Lin YW, Yu SL, Shao HY, et al. Human SCARB2 transgenic mice as an infectious animal model for enterovirus 71[J]. PLoS One, 2013, 8(2): e57591. DOI:10.1371/journal.pone.0057591

[29]Darren RS, Douglas JD, Rebecca AI, et al. Coxsackievirus A21 binds to decay-accelerating factor but requires intercellular adhesion molecule 1 for cell entry[J]. J Virol, 1997, 71(6): 4736-4743.

[30]Kuo RL, Shih SR. Strategies to develop antivirals against enterovirus 71[J]. Virol J, 2013, 10: 28.

[31]Foo DG, Alonso S, Chow VT, et al. Passive protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by neutralizing antibodies elicited by a synthetic peptide[J]. Microbes Infect, 2007, 9: 1299-1306. DOI:10.1016/j.micinf.2007.06.002

[32]Clinical Experts Group of the Ministry of Health for Hand, Foot and Mouth Disease. Experts consensus on rescue and treatment of severe cases with enterovirus 71 (EV71) infection[J]. Chin J Pediatr, 2011, 49(9): 675-678. (in Chinese)

衛(wèi)生部手足口病臨床專家組. 腸道病毒71型(EV71)感染重癥病例臨床救治專家共識[J]. 中華兒科雜志, 2011, 49(9):675-678.

[33]Lu G, Qi J, Chen Z, et al. Enterovirus 71 and coxsackievirus A16 3C proteases: binding to rupintrivir and their substrates and anti-hand, foot, and mouth disease virus drug design[J]. J Virol, 2011, 85(19): 10319-10331.

[34]Chen TC, Chang HY, Lin PF, et al. Novel antiviral agent DTriP-22 targets RNA-dependent RNA polymerase of enterovirus 71[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(7): 2740-2747.

[35]Liu J, Li X, Fan X, et al. Adoptive transfer of macrophages from adult mice reduces mortality in mice infected with human enterovirus 71[J]. Arch Virol, 2013, 158(2): 387-397. DOI:10.1007/s00705-012-1495-4

[36]Yi L, He Y, Chen Y, et al. Potent inhibition of human enterovirus 71 replication by type I interferon subtypes[J]. Antivir Ther, 2011, 16(1): 51-58. DOI:10.3851/IMP1720

[37]Tan CW, Chan YF, Sim KM, et al. Inhibition of enterovirus 71 (EV-71) infections by a novel antiviral peptide derived from EV-71 capsid protein VP1[J]. PLoS One, 2012, 7(5): e34589. DOI:10.1371/journal.pone.0034589

[38]Ku Z, Ye X, Huang X, et al. Neutralizing antibodies induced by recombinant virus-like particles of enterovirus 71 genotype C4 inhibit infection at pre- and post-attachment steps[J]. PLoS One, 2013, 8(2): e57601. DOI:10.1371/journal.pone.0057601

[39]Chou AH, Liu CC, Chang JY, et al. Immunological evaluation and comparison of different EV71 vaccine candidates[J]. Clin Dev Immunol, 2012, 2012: 831282. DOI:10.1155/2012/831282

[40]Chen HF, Chang MH, Chiang BL, et al. Oral immunization of mice using transgenic tomato fruit expressing VP1 protein from enterovirus 71[J]. Vaccine, 2006, 24: 2944-2951. DOI:10.1016/j.vaccine.2005.12.047

[41]Liang ZL, Mao QY, Wang YP, et al. Progress on the research and development of inactivated EV71 whole-virus vaccines[J]. Hum Vaccin Immunother, 2013, 9(8): 1-5. DOI:10.4161/hv.24949

[42]Liang Z, Mao Q, Gao F, et al. Progress on the research and development of human enterovirus 71 (EV71) vaccines[J]. Front Med, 2013, 7(1): 111-121. DOI:10.1007/s11684-012-0237-z

[43]Chang JY, Chang CP, Tsai HH, et al. Selection and characterization of vaccine strain for Enterovirus 71 vaccine development[J]. Vaccine, 2012, 30(4): 703-711. DOI:10.1016/j.vaccine.2011.11.087

[44]Liu CC, Chang HW, Yang G, et al. Development of a quantitative enzyme linked immunosorbent assay for monitoring the Enterovirus 71 vaccine manufacturing process[J]. J Virol Methods, 2011, 176(1-2):60-68. DOI:10.1016/j.jviromet.2011.06.001

[45]Liang ZL, Mao QY, Gao Q, et al. Establishing China’s national standards of antigen content and neutralizing antibody responses for evaluation of enterovirus 71 (EV71) vaccines[J]. Vaccine, 2011, 29: 9668-9674. DOI:10.1016/j.vaccine.2011.10.018

[46]Mao Q, Dong C, Li X, et al. Comparative analysis of the immunogenicity and protective effects of inactivated EV71 vaccines in mice[J]. PLoS One, 2012, 7(9): e46043. DOI:10.1371/journal.pone.0046043

[47]Zhu FC, Wang JZ, Li XL, et al. Reactogenicity and immunogenicity of an enterovirus 71 vaccine in Chinese healthy children and infants[J]. Pediatr Infect Dis J, 2012, 31(11): 1158-1165. DOI:10.1097/INF.0b013e31826eba74

[48]Huang ML, Chiang PS, Chia MY, et al. Cross-reactive neutralizing antibody responses to Enterovirus 71 infections in young children: Implications for vaccine development[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7(2): e2067. DOI:10.1371/journal.pntd.0002067

[49]Han JF, Cao RY, Deng YQ, et al. Antibody dependent enhancement infection of enterovirus 71invitroandinvivo[J]. Virol J, 2011, 8: 106. DOI:10.1186/1743-422X-8-106

[50]Mao QY, Li N, Yu X, et al. Antigenicity, animal protective effect and genetic characteristics of candidate vaccine strains of enterovirus 71[J]. Arch Virol, 2012, 157: 37-41. DOI 10.1007/s00705-011-1136-3