葛根通脈飲誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

陳 芳郜新蓮* 沈曉君趙君玫

（1 河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003；2 河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008）

葛根通脈飲誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

陳 芳1郜新蓮2* 沈曉君2趙君玫2

（1 河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003；2 河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008）

目的研究葛根通脈飲對(duì)同型半胱氨酸（homocysteinemia，HCY）誘導(dǎo)增殖大鼠血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的促凋亡作用。方法制備葛根通脈飲含藥血清，大鼠VSMC原代培養(yǎng)、鑒定，分為空白組、HCY組、葛根通脈飲組、瑞舒伐他?。啥ǎ┙M、葛根通脈飲聯(lián)合可定組。藥物干預(yù)后，Annexin/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果與空白組比較，HCY組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）；與HCY組比較，葛根通脈飲組、可定組、葛根通脈飲聯(lián)合可定組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論葛根通脈飲可促進(jìn)HCY誘導(dǎo)增殖的大鼠VSMC凋亡，可能是其抗動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）作用機(jī)制之一。

葛根通脈飲；同型半胱氨酸；血管平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）過(guò)度增殖是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）形成的主要病理機(jī)制之一，抑制VSMC增殖是防止AS病變發(fā)生發(fā)展、減輕血管重構(gòu)的的關(guān)鍵[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察我院的院內(nèi)制劑葛根通脈飲對(duì)同型半胱氨酸（homocysteinemia，HCY）誘導(dǎo)增殖大鼠VSMC的促凋亡作用，探討其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制，為葛根通脈飲臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 葛根通脈飲和瑞舒伐他?。啥ǎ┖幯逯苽?/p>

葛根通脈飲由葛根30 g、山楂15 g、太子參12 g、當(dāng)歸尾6 g、淫羊藿6 g、赤芍6 g、川芎6 g、甘草6 g等組成，藥材購(gòu)自河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房并由制劑室制備成中藥湯劑。瑞舒伐他?。啥ǎ?，阿斯利康制藥有限公司，國(guó)A2002002。新西蘭大白兔給藥劑量為臨床用藥劑量的5倍，每日劑量分2次灌胃，連續(xù)5 d，末次給藥后1 h，腹主動(dòng)脈取血，離心、分離備用。

1.1.2 主要儀器與試劑

CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀（BD.USA公司產(chǎn)品）；FLUOVIEW FV100共聚焦熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；DMEM、胰蛋白酶（Gibco BRL. USA產(chǎn)品）；Ⅱ型膠原酶 （Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）；α-SMA抗體（武漢博士德公司產(chǎn)品）；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物公司產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VSMC原代培養(yǎng)

雄性wistar大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。戊巴比妥鈉腹腔麻醉后迅速分離、取出腹主動(dòng)脈，小心剝除血管外膜，縱行剪開(kāi)血管。PBS洗兩次，剪成0.5～2 mm大小的組織塊，放入含有1 mg/mLⅡ型膠原酶溶液的離心管中，37 ℃溫箱中消化30 min。劇烈震蕩離心管，除去內(nèi)皮細(xì)胞，將取出的組織塊放入1 mg/mL II型膠原酶溶液中，37 ℃溫箱中消化4～6 h，待組織塊呈絮狀后終止消化。離心，去上清，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞長(zhǎng)至75%匯合度時(shí)，消化傳代，取2～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 原代培養(yǎng)的大鼠VSMC免疫組織化學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞接種到6孔板中，培養(yǎng)72 h，去上清，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，加入0.3%TritonX-100，倒掉后再加入TritonX-100室溫透化15 min，滴加30 μL血清封閉液（二抗宿主來(lái)源），室溫封閉30 min。加入一抗α-SMA抗體（1∶50），4 ℃孵育過(guò)夜。加入FITC標(biāo)記羊抗小鼠二抗（1∶100），37 ℃孵育30 min，同時(shí)加4’，6二脒基-2-苯吲哚鹽酸（4’，6-diamino-2-phenylindole，DAPI）染細(xì)胞核，37 ℃孵育30 min，封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 細(xì)胞分組與藥物干預(yù)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。將處理好的蓋玻片放入6孔板各孔中，每孔準(zhǔn)確接種900 μL細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)后將細(xì)胞分為空白組、HCY組、葛根通脈飲組、瑞舒伐他?。啥ǎ┙M、葛根通脈飲聯(lián)合可定組。除空白組外，各組均加入劑量為10-4mol/L同型半胱氨酸，培養(yǎng)24 h后，葛根通脈飲組加入葛根通脈飲含藥血清，可定組加入可定含藥血清，葛根通脈飲聯(lián)合可定組同時(shí)加入葛根通脈飲、可定含藥血清，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。

1.2.4 Annexin V-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

各組細(xì)胞用PBS洗滌，0.125%胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管，加培養(yǎng)液，混勻，1000 r/min離心，棄上清，加PBS，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，取0.5 mL細(xì)胞懸液，1000 r/min離心4 min，棄上清，加0.5 mL Binding Buffer，重懸細(xì)胞，加1 μL熒光標(biāo)記的annexin V試劑，混勻，室溫下避光孵育20 min，加入PI 5 μL，混勻后4 ℃下避光孵育5 min，加入Binding Buffer 500 μL，隨即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，用Flow max 2.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

各組細(xì)胞測(cè)定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，使用SPSS10. 0軟件包進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 原代培養(yǎng)的大鼠VSMC形態(tài)及免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

倒置相差顯微鏡觀察，培養(yǎng)的細(xì)胞多數(shù)呈長(zhǎng)梭形，核大，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色，可見(jiàn)明顯的肌絲纖維。免疫組化結(jié)果顯示，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)特異性標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)呈陽(yáng)性者超過(guò)98%的，提示培養(yǎng)細(xì)胞為VSMC。

2.2 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

與空白組（4.36±0.25）比較，HCY組（1.17±0.15）細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），提示HCY可誘導(dǎo)VSMC增殖；葛根通脈飲、可定均可顯著促進(jìn)VSMC凋亡，葛根通脈飲組（3.08±0.14）、可定組（2.35 ±0.24）、葛根通脈飲聯(lián)合可定組（3.23±0.22）大鼠VSMC凋亡百分率與HCY組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討 論

AS及其所致的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中是目前世界范圍內(nèi)兩大主要死亡原因[2]。研究證實(shí)，AS的主要病理形態(tài)學(xué)特征之一是VSMC向動(dòng)脈內(nèi)膜的遷移和增殖。脂質(zhì)代謝紊亂、高HCY血癥等AS危險(xiǎn)因素可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血小板和單核巨噬細(xì)胞黏附、聚集，血小板釋放的細(xì)胞因子促使VSMC遷移至血管內(nèi)膜，在內(nèi)膜增殖后，VSMC和巨噬細(xì)胞荷脂形成泡沫細(xì)胞，VSMC還可合成膠原纖維等基質(zhì)，進(jìn)而形成AS斑塊，因此，抑制VSMC遷移和增殖，對(duì)于延緩或阻止AS病變發(fā)生發(fā)展及心血管病防治具有重大意義[3]。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)[4-6]，作為單體的葛根素具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)血脂水平，抑制VSMC增殖等良好的抗AS作用，葛根素預(yù)防性給藥能明顯抑制兔主動(dòng)脈AS病變，其機(jī)制與調(diào)控細(xì)胞周期、影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平、抑制AS過(guò)程中炎性反應(yīng)等密切相關(guān)。在前期工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)臨證經(jīng)驗(yàn)，我們以葛根為主藥，將葛根通脈飲方劑應(yīng)用于臨床，治療AS及其所致心腦血管疾病。方中葛根升陽(yáng)解痙，通利血脈為君；赤芍、川芎行血活血，山楂活血散瘀、化痰行氣，共助葛根散瘀通脈為臣；淫羊藿、太子參升提脾腎之陽(yáng)氣，當(dāng)歸補(bǔ)血養(yǎng)血，三藥同用，達(dá)氣帥血行，通而不滯之功，為佐藥；炙甘草補(bǔ)中益氣，固護(hù)脾胃，調(diào)和諸藥為使。本實(shí)驗(yàn)中，葛根通脈飲組和葛根通脈飲聯(lián)合可定組大鼠VSMC凋亡百分率顯著高于HCY組，提示葛根通脈飲可顯著促進(jìn)VSMC凋亡，可能是其抗AS作用機(jī)制之一。

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[3] 李桂源.病理生理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:341-350.

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[5] 魏群,陳芳,沈曉君,等.葛根素對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化炎性因子的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2011,31(18):3541-3543.

[6] 沈曉君,魏群,陳芳,等.葛根素對(duì)血管平滑肌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2011,17(1):69-70.

R285.5

B

1671-8194（2014）24-0069-02

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（13A310612）

*通訊作者：E-mail：shenxiaojun0628@163.com