賀蘭山地區(qū)油松根際固氮菌的多樣性研究

牛艷芳， 陳立紅， 閆 偉

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

賀蘭山地區(qū)油松根際固氮菌的多樣性研究

牛艷芳， 陳立紅， 閆 偉

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

對賀蘭山北寺自然保護區(qū)油松(Pinustabulaeformis)的根際土壤固氮菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)進行研究。采用阿須貝培養(yǎng)基對土壤中的固氮菌進行分離和純化，用通用引物27f/1492r對固氮菌進行16S rDNA擴增并測序，應(yīng)用 DNAMAN 6.0軟件進行多序列比對，用 MEGA 4.0軟件構(gòu)建聚類樹。結(jié)果表明: 從賀蘭山北寺油松根際土壤中分離出的固氮菌屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、柄細菌屬(Caulobacter)、土地桿菌屬(Pedobacter) 等9個不同的類群，其中假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)是優(yōu)勢類群。這表明賀蘭山北寺地區(qū)油松根際土壤中固氮菌具有較豐富的多樣性。

賀蘭山； 油松； 固氮菌； 多樣性

賀蘭山呈南北走向，屬陰山山脈，地理坐標為東經(jīng)105°41′—106°05′、北緯38°20′— 39°12′，坐落于阿拉善高原與銀川平原之間，是毛烏素沙地、烏蘭布和沙漠、騰格里沙漠與銀川平原的重要分界線，是連接青藏高原、蒙古高原和華北植物區(qū)系的樞紐[1-2]。賀蘭山特殊的地理位置和地理環(huán)境塑造了賀蘭山獨特的生物類群，是我國西部干旱區(qū)重要的生物資源寶庫，生物類型具有典型的多樣性和交叉性[3]。賀蘭山具有典型的大陸性氣候特征，年降水量275 mm，年平均氣溫8.5 ℃。森林覆蓋度是13.4%，森林地帶土壤為山地灰褐土，偏弱堿性。森林類型主要為針葉林，在賀蘭山陰坡海拔1980-3100 m之間分布有溫性針葉林(油松林Pinustabulaeformis)、寒溫性針葉林(青海云杉林Piceacrassifolia)和亞高山針葉林(青海云杉林含高寒灌木)；在賀蘭山陽坡海拔1800～2700 m之間分布有灰榆(Ulmusglaucescens)和杜松(Juniperusrigida)疏林，此外還有虎榛子、高山柳、山楊、丁香等樹種的分布[4]。目前，對賀蘭山植物的多樣性研究較多，但是對土壤微生物多樣性的研究明顯不足，很有必要加大對賀蘭山地區(qū)土壤微生物的研究力度。

固氮菌可以將空氣中的分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為植物可以利用氮源，生物固氮作用是生物圈氮素的主要來源，對于森林植被的生長發(fā)育具有重要的作用[5-10]。森林生態(tài)系統(tǒng)作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的主體，在調(diào)節(jié)全球碳平衡和減緩全球氣候變化進程中扮演著重要角色，具有其它生態(tài)系統(tǒng)無可替代的作用[11-13]。因此，研究內(nèi)蒙古地區(qū)主要針葉樹種根際固氮菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)具有重要的意義，可為森林生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。本文對賀蘭山北寺自然保護區(qū)主要針葉樹種油松根際土壤固氮菌進行分離、純化和鑒定，分析其土壤中固氮菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)特性，以期為篩選適合于內(nèi)蒙古及西部地區(qū)的優(yōu)良固氮菌菌株和固氮菌菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣品采集

土壤樣品采集地點在賀蘭山北寺自然保護區(qū)的油松林。采集油松根際土壤裝入無菌的封口袋編號標記，帶回后放置于4 ℃冰箱儲藏。

1.2根際土壤固氮菌的分離純化

采用阿須貝培養(yǎng)基(葡萄糖10 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO40.2 g、CaCO35 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2)分離和純化土壤樣品中的固氮菌。稱取土樣10 g，放入裝有90 mL無菌水的加玻璃珠的三角瓶中，在搖床上150 r/min振蕩20 min。依次制成10-3、10-4、10-5三個不同稀釋度的土壤懸液，分別接種到培養(yǎng)皿中，用無菌玻璃棒涂布均勻，28℃恒溫培養(yǎng)6～7天。將培養(yǎng)出來的固氮菌菌落利用劃線法進行分離，約4～5代可以分離到純種的固氮菌。將純化后的固氮菌保存到試管，放到4℃冰箱備用[14-16]。

1.316SrDNA片段擴增

利用SDS法提取固氮菌基因組DNA。以基因組DNA為模板，采用細菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/ 1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rDNA。反應(yīng)體系如下(總體積25 μL)：12.5 μL Daeam Tap Green PCR Master Mix(2X)，1.0 μL 10 μmol/L引物27f，1 μL 10 μmol/L引物1492 r，1.0 μL模板DNA，9.5 μL ddH2O。擴增反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，43 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 15 min[17-18]。

1.4聚類樹構(gòu)建

由上海生工生物工程有限公司進行PCR產(chǎn)物測序，將測定的序列通過Blast與 GenBank 中已知菌種的 16S rDNA序列同源性比較進行菌種鑒定，利用DNAMAN軟件多序列比對并人工校對，利用MEGA(version 4.0)軟件計算Kimura’s two-parameter遺傳距離并構(gòu)建UPGMA自展一致系統(tǒng)發(fā)育樹，自展重復總數(shù)為1000[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1固氮菌鑒定及聚類分析

采用阿須貝無氮培養(yǎng)基對采自賀蘭山北寺油松根際土壤中的固氮菌進行分離。根據(jù)菌落形態(tài)、大小和顏色，分離出47株固氮菌。以通用引物27 f 和1492r 對分離菌株的16S rDNA 基因片段進行擴增，并通過16S rDNA序列對固氮菌菌株進行鑒定。應(yīng)用 DNAMAN 6.0 軟件對分離出菌株的16S rDNA序列進行多序列比對，用MEGA 4.0軟件構(gòu)建聚類樹。

從圖1可以看出，賀蘭山北寺地區(qū)油松根際土壤中固氮菌具有較豐富的多樣性，它們分布于9個系統(tǒng)發(fā)育分支上。菌株 AY2、AY3、AY5、AY10、AY36、AY42、AY44、AY47、AY48、AY50、AY 52、AY 53 等菌株聚在一起，屬于葉桿菌屬(Phyllobacterium)；菌株 AY4、AY7、AY12、AY13、AY15、AY21、AY22、AY25、AY33、AY41、AY 43等菌株聚在一起，屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)；菌株 AY8、AY9、AY14、AY16、AY17、AY23、AY26、AY40、AY46、AY49等菌株聚在一起，屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)；菌株AY24、AY31、AY32、AY34、AY35、AY37等菌株聚在一起，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)；菌株 AY1、AY6、AY19、AY30等菌株聚在一起，屬于根瘤菌屬(Rhizobium)；菌株AY20屬于柄細菌屬(Caulobacter)，菌株AY29屬于鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)；菌株AY39屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)，菌株AY11屬于土地桿菌屬(Pedobacter)。

圖1 固氮菌基于16S rDNA序列的聚類樹Fig.1 UPGMA tree based on 16S rDNA sequences from nitrogen-fixing bacteria strains

2.2賀蘭山油松根際固氮菌群落結(jié)構(gòu)分析

從賀蘭山北寺油松根際土壤中共分離出固氮菌47株。其中假單胞菌屬(Pseudomonas)有11株，占23.40%；葉桿菌屬(Phyllobacterium)有12株，占25.53%；節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)有10株，占21.28%；芽孢桿菌屬(Bacillus)有6株，占12.77%；根瘤菌屬(Rhizobium)有4株，占8.51%；其它類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、柄細菌屬(Caulobacter)、土地桿菌屬(Pedobacter)等4個屬的固氮菌4株，共占8.51%。在賀蘭山北寺油松根際土壤中假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)是優(yōu)勢屬，它們的數(shù)量從多到少的順序為：葉桿菌屬(Phyllobacterium)>假單胞菌屬(Pseudomonas)>節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)>芽孢桿菌屬(Bacillus)。不同固氮菌類群所占的比率詳見表1。

3 結(jié)論與討論

植物根際促生菌( PGPR) 是在植物根際定殖并可促進植物生長的細菌，其中根際固氮菌是PGPR中重要功能菌群之一[18]。我國對植物根際固氮菌的研究，主要在水稻、小麥、玉米、大豆、棉花、煙草、甘蔗、枸杞、茶等糧食和經(jīng)濟作物上。韓曉陽等[8]在山東茶園土壤中分離出6 株高效固氮菌株，經(jīng)鑒定為褐球固氮菌(Azotobacterchrococcum)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，接種該固氮菌可明顯促進茶樹根、莖、葉的生長。王超群等[20]從大豆根際土壤中分離的固氮菌為微桿菌(Microbacteriumsp.)、鏈霉菌(Streptomycessp.)和小單孢菌(Micromonosporasp.)等，不但具有一定的固氮能力并能分泌 IAA，在制備大豆生物菌肥方面具有較好的應(yīng)用前景。劉驍蒨等[21]研究了秸稈還田與施肥對稻田土壤微生物生物量及固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響。

目前，對森林樹種根際固氮菌的研究相對較少。本文從賀蘭山北寺油松根際土壤中分離出的47株固氮菌，它們分布于9個系統(tǒng)發(fā)育分支上，其中假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter) 屬于優(yōu)勢類群。該結(jié)果表明賀蘭山北寺油松根際土壤中固氮菌具有較豐富的多樣性。

[1] 杜茜, 閆興富. 賀蘭山植被類型多樣性及空間分布特征[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38(7):3666-3667.

[2] 劉秉儒, 張秀珍, 胡天華, 等. 賀蘭山不同海拔典型植被帶土壤微生物多樣性[J]. 生態(tài)學報, 2013, 33(22):7211-7220.

[3] 朱宗元, 馬毓泉, 劉鐘齡, 等. 阿拉善—鄂爾多斯微生物多樣性中心的特有植物和植物區(qū)系的性質(zhì)[J]. 干旱區(qū)資源與環(huán)境, 1999, 13(2): 1-15.

[4] 梁存柱, 朱宗元, 王煒, 等. 賀蘭山植物群落類型多樣性及其空間分布[J]. 植物生態(tài)學報, 2004 , 28(3):361-368.

[5] 王紹友, 李季倫. 固氮酶催化機制及化學模擬生物固氮研究進展[J]. 自然科學進展, 2000, 10 (6): 481-490.

[6] 趙秀云, 韓素芬. 楊樹根際固氮菌的分離、篩選和鑒定[J]. 南京林業(yè)大學學報, 2000, 24(3):17-20.

[7] 覃小紅, 黃寶靈, 善華. 固氮菌對桉樹促生作用及其影響因素試驗[J]. 林業(yè)實用技術(shù), 2012(8):3-5.

[8] 韓曉陽, 李智, 張麗霞, 等. 茶園土壤高活性固氮菌的篩選鑒定及接種效果初步研究[J]. 茶葉科學, 2014, 34(5):497-505.

[9] 周德明, 李蓉. 杉木根際固氮菌篩選及其溶磷性與分泌 IAA 特性研究[J]. 四川師范大學學報:自然科學版, 2012, 35(4):562-566.

[10] 郭飛, 蔣雪剛, 黃寶靈, 等. 促生菌接種馬尾松育苗試驗[J]. 廣西林業(yè)科學, 2013, 42(1):71-76.

[11] JC Gorden, CT Wheeler. 森林生態(tài)系統(tǒng)中的生物固氮[M]. 王沙生, 譯. 北京:中國林業(yè)出版社, 1990:237-280.

[12] 陳奮飛, 莊捷, 王逸群. 我國林木固氮的研究現(xiàn)狀和前景展望[J]. 湖南林業(yè)科技, 2006, 33(4): 4-7.

[13] 王巖, 沈其榮. 土壤微生物量及其生態(tài)效應(yīng)[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報, 1996, 19(4): 45-51.

[14] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2001.

[15] 丁延芹, 王建平, 劉元, 等. 幾株固氮芽孢桿菌的分離與鑒定[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2004, 12(6): 690-697.

[16] 凌娟, 董俊德, 張燕英, 等. 一株紅樹林根際固氮菌的分離、鑒定以及固氮活性測定[J]. 熱帶海洋學報，2010，29(5): 149-153.

[17] 田國杰, 王晗, 陳立紅. 內(nèi)蒙古赤峰地區(qū)主要樹種根際固氮菌的分離和鑒定[J]. 內(nèi)蒙古林業(yè)科技, 2016, 42(1): 21-26.

[18] 唐貽軍, 程潔, 梅麗娟, 等. 植物根際促生菌的篩選及鑒定[J]. 微生物學報,2010, 50(7): 853-861.

[19] Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J].Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8):1596-1599.

[20] 王超群, 劉 帥, 王曉璐, 等. 大豆根際高效自生固氮菌分離鑒定與特性研究[J]. 大豆科學, 2015, 34(5):850-854.

[21] 劉驍蒨, 涂仕華, 孫錫發(fā), 等. 秸稈還田與施肥對稻田土壤微生物生物量及固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J].生態(tài)學報, 2013, 33( 17) :5210-5218.

Diversityofnitrogen-fixingbacteriaisolatedfromPinustabulaeformisinHelanMountains

NIU Yanfang, CHEN Lihong, YAN Wei

(Inner Mongolia Agricultural University, Huhehot 010019, China)

The diversity and community structure of nitrogen-fixing bacteria isolated fromPinustabulaeformisrhizosphere in Helan Mountains was studied. Nitrogen-fixing bacteria from rhizosphere soil were isolated and purified by Ashby’s Medium, the 16S rDNA gene of nitrogen-fixing bacteria was amplified using primers 27f/1492r and sequenced, the alignment of 16S rDNA sequences was conducted by DNAMAN 6.0, and the neighbor-joining phylogenetic tree was constructed by MEGA 4.0 software. The results showed that nitrogen-fixing bacteria isolated fromP.tabulaeformisbelonged to nine groups, which werePseudomonas,Bacillus,Phyllobacterium,Arthrobacter,Rhizobium,Paenibacillus,Sphingomonas,Caulobacter,Pedobacter,andPseudomonas,Bacillus,Phyllobacterium,Arthrobacterwere dominant groups. The results indicated that nitrogen-fixing bacteria fromP.tabulaeformisin Helan Mountains have rich diversity.

Helan Mountains;Pinustabulaeformis; nitrogen-fixing bacteria; diversity

2016-06-20

國家自然科學基金項目(31260173)。

牛艷芳(1977-)，女，內(nèi)蒙古包頭人，博士研究生，研究方向為林木生物技術(shù)。

陳立紅，女，博士，副教授；E-mail:chenlihong@imau.edu.cn

Q 93

A

1003-5710(2016)05-0017-05

10.3969/j. issn. 1003-5710. 2016. 05. 004

(文字編校：張 珉)