Nodal與腫瘤:表達(dá)特征和功能分析①

曾凡才 趙太強(qiáng) 周 紅(電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610054)

Nodal分子是胚胎發(fā)育中一個重要的形態(tài)發(fā)生素分子(Morphogen)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員。它在維持胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)、誘導(dǎo)中胚層和形成內(nèi)臟器官左右不對稱性等過程中發(fā)揮重要作用［1］。Nodal基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)，而在胚胎晚期呈低表達(dá)，在成年正常個體中僅表達(dá)于少數(shù)幾種生殖系統(tǒng)組織［2］。最近研究表明Nodal分子在多種惡性腫瘤中表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，說明Nodal分子可能作為腫瘤診斷的標(biāo)志分子和靶向治療的靶點(diǎn)。本文將綜述Nodal分子的特點(diǎn)及其與腫瘤的關(guān)系。

1 Nodal的分子生物學(xué)特征及功能

1993年，Zhou等［3］首先從小鼠胚胎cDNA文庫中克隆獲得Nodal基因，并定位于10號染色體。人Nodal基因也位于10號染色體(10q22.1)上，該基因包含有3個外顯子和2個內(nèi)含子［4］。Nodal基因除編碼區(qū)外，至少還包含三個獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大約10 kb的結(jié)節(jié)特異性增強(qiáng)子(Node-specific enhancer，NDE)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大約4 kb的左側(cè)體軸增強(qiáng)子(Left sidespecific enhancer，LSE)和第一內(nèi)含子中的不對稱增強(qiáng)子(Asymmetric enhancer，ASE)［5］。Nodal基因編碼的蛋白質(zhì)屬于TGF-β超家族成員，Nodal前體蛋白由347個氨基酸組成，其中1～26位氨基酸是信號肽(Signal peptide)，27～237位氨基酸是前體結(jié)構(gòu)域(Prodomain)，238～347位氨基酸是成熟肽結(jié)構(gòu)域(Mature domain)。在PACE-4和Furin等枯草桿菌蛋白酶樣前體蛋白轉(zhuǎn)換酶的作用下，Nodal前體蛋白可生成一條含110個氨基酸的成熟多肽［1，6］。該成熟多肽具有TGF-β超家族的特征性結(jié)構(gòu)，即含有7個保守的半胱氨酸。成熟多肽通過一對二硫鍵連接生成具有生物學(xué)活性的同源二聚體Nodal分子。

Nodal分子在胚胎發(fā)育過程中起重要作用，敲除Nodal基因會導(dǎo)致小鼠胚胎死亡，人Nodal基因先天性突變也可導(dǎo)致內(nèi)臟異位癥的發(fā)生［4］。Nodal分子主要表達(dá)在胚胎組織中，在成年正常組織中一般不表達(dá)［2］。最近研究發(fā)現(xiàn)Nodal分子表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞中，提示Nodal分子可能與腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)［7］，然而Nodal分子在腫瘤中表達(dá)的機(jī)制和功能并未完全清楚。

2 Nodal信號通路

與其他TGF-β超家族成員類似，Nodal分子以旁分泌和自分泌方式發(fā)揮作用。分泌于胞外的Nodal前體蛋白在前體蛋白轉(zhuǎn)換酶的作用下，加工成具有生物學(xué)活性的同源二聚體。成熟的Nodal分子與細(xì)胞膜上的激活素Ⅱ型受體B(Activin typeⅡreceptor B，ActRⅡB)和激活素Ⅰ型受體(Activin receptor-like kinase，ALK)4(ALK4)或ALK7以及共受體Cripto-1相互作用將信號傳遞到胞內(nèi)。與Nodal結(jié)合的Ⅱ型受體ActRⅡB以及Ⅰ型受體ALK4和ALK7均屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，此兩類受體都由一個短的胞外結(jié)構(gòu)域，一個單跨膜結(jié)構(gòu)域和一個長的胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域組成。在胞外結(jié)構(gòu)域中有糖基化位點(diǎn)和富含半胱氨酸區(qū)域。在Ⅰ型受體胞內(nèi)近膜區(qū)域有一保守的富含甘氨酸和絲氨酸的GS結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域在Ⅱ型受體中缺失。當(dāng)成熟的二聚體Nodal分子與Ⅱ型受體ActRⅡB二聚體結(jié)合后，再與兩分子Ⅰ型受體ALK4或ALK7靠近并催化Ⅰ型受體GS結(jié)構(gòu)域磷酸化，使Ⅰ型受體被激活。激活的Ⅰ型受體可使胞內(nèi)的Smad2(receptor-regulated similar to mothers against decapentaplegic homolog)磷酸化，Smad2與Smad4形成復(fù)合物，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，與FoxH1和Mixer1等轉(zhuǎn)錄因子以及輔激活物或輔阻遏物結(jié)合，調(diào)控靶基因表達(dá)以發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)［8］。通過這條信號通路Nodal分子不僅能夠促進(jìn)其天然抑制因子Lefty-A和-B的表達(dá)，還可正反饋的刺激Nodal分子自身表達(dá)，以平衡Nodal分子在生物體內(nèi)的作用［7，9］。

3 Nodal分子與腫瘤

3.1 Nodal分子與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展 胚胎干細(xì)胞表達(dá)的Nodal分子在細(xì)胞分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而一般成年正常組織中不表達(dá)Nodal分子，但在惡性腫瘤細(xì)胞中又重新表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)Nodal分子的腫瘤細(xì)胞中上調(diào)Nodal表達(dá)會促進(jìn)細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡和增加細(xì)胞浸潤能力［7，10，11］。而在高表達(dá) Nodal分子的腫瘤細(xì)胞中抑制Nodal表達(dá)會明顯降低腫瘤細(xì)胞的致瘤性［7，10，11］。研究發(fā)現(xiàn) Nodal分子可通過促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2表達(dá)進(jìn)而增加腫瘤細(xì)胞的浸潤能力，Nodal分子還能增加VEGF的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤血管生成［11-13］。動物實(shí)驗(yàn)表明:Nodal分子可促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移灶形成和黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移［5，10］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)Nodal分子在惡性乳腺癌和結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，而在癌旁正常組織不表達(dá)或低表達(dá)(待發(fā)表)。上述結(jié)果表明Nodal與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展可能密切相關(guān)，但是Nodal分子在腫瘤中的功能及其重新表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，下面介紹Nodal分子在幾種腫瘤中作用的研究進(jìn)展。

3.2 Nodal分子與黑色素瘤 多項(xiàng)研究表明Nodal分子在黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Topczewska等［7］發(fā)現(xiàn) Nodal分子在正常皮膚不表達(dá)，在低浸潤性黑色素瘤中低表達(dá)，但在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中高表達(dá)。另外，Nodal分子在具有轉(zhuǎn)移能力的黑色素瘤細(xì)胞系C8161、WM278和1205LU中高表達(dá)，而在非轉(zhuǎn)移性的黑色素瘤細(xì)胞株C81-61中低表達(dá)或不表達(dá)［7］。這提示Nodal分子可作為黑色素瘤發(fā)展過程中的生物標(biāo)志分子。在黑色素瘤細(xì)胞C81-61中，用ALK4/5/7受體抑制劑SB-431542阻斷Nodal信號通路，可使該細(xì)胞在裸鼠移植瘤中的浸潤能力顯著降低;用 Nodal靶向的 Morpholino(MONodal)特異抑制Nodal的表達(dá)，可明顯降低該腫瘤細(xì)胞在裸鼠中的致瘤性。當(dāng)MONodal對Nodal表達(dá)抑制失效(即有Nodal重新表達(dá))時，該細(xì)胞的致瘤性也恢復(fù)。進(jìn)一步研究證明:這種Nodal抑制引起的黑色素瘤細(xì)胞致瘤性降低是由于它的增殖抑制和凋亡加快的結(jié)果［14］。臨床研究數(shù)據(jù)表明Nodal分子表達(dá)與黑色素瘤進(jìn)展正相關(guān)，提示Nodal分子有可能作為腫瘤治療的靶點(diǎn)［5］。McAllister等［15］研究認(rèn)為Nodal基因表達(dá)與代表黑色素瘤惡性發(fā)展的血管生成擬態(tài)樣結(jié)構(gòu)形成相關(guān)。另一組研究人員用免疫組化方法檢測黑色素相關(guān)疾病組織中Nodal分子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Nodal分子在正常組織及發(fā)育異常痣中呈低表達(dá)，但隨惡性黑色素瘤的發(fā)展，Nodal分子表達(dá)逐漸增加［16］。有研究認(rèn)為腫瘤的低氧環(huán)境誘導(dǎo)了黑色素瘤細(xì)胞中Nodal分子表達(dá)，從而增加了黑色素瘤細(xì)胞的浸潤性和血管生成能力［17］。Fang等［18］發(fā)現(xiàn)Nodal可通過轉(zhuǎn)錄因子Snail促進(jìn)腫瘤的惡性發(fā)展。以上結(jié)果表明Nodal在黑色素瘤發(fā)展過程中起重要作用并與黑色素瘤進(jìn)展正相關(guān)，可成為黑色素瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

3.3 Nodal分子與乳腺癌 在乳腺組織中，Nodal分子在發(fā)育期乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中表達(dá)，并促進(jìn)乳腺導(dǎo)管分枝形成，而且Nodal表達(dá)異?？蓪?dǎo)致導(dǎo)管上皮解體［19］。因此，Nodal對乳腺的正常分化發(fā)育十分重要，在成年人正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中不表達(dá)，然而在乳腺癌細(xì)胞株和乳腺癌組織中均出現(xiàn)高表達(dá)［14，20］。與低浸潤性乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7 和T47D相比，Nodal在高浸潤性乳腺癌細(xì)胞株MDAMB-231、MDA-MB-468 和 Hs578t中表達(dá)增強(qiáng)［10］。Nodal促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和減少細(xì)胞凋亡，并且與乳腺癌轉(zhuǎn)移灶形成密切相關(guān)［10］。與黑色素瘤類似，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞Nodal表達(dá)，增加癌細(xì)胞的浸潤性和血管生成能力［17］。臨床研究發(fā)現(xiàn)低分化浸潤性乳腺癌比良性和早期乳腺癌有更高的Nodal表達(dá)，而且用特異性Nodal單克隆抗體明顯減少乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［20］。豐富的血管對惡性腫瘤是必需的，高的微血管密度也是腫瘤預(yù)后不良的指標(biāo)，有研究證實(shí)Nodal高表達(dá)能促進(jìn)乳腺癌中血管生成從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［13］。以上結(jié)果表明雖然Nodal對乳腺的正常發(fā)育是必需的，但表達(dá)異?？赡艽龠M(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

3.4 Nodal分子與膠質(zhì)瘤 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中Nodal表達(dá)水平與這些細(xì)胞株浸潤能力呈正相關(guān)［11］。用重組Nodal(rNodal)蛋白處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞會增加MMP-2的分泌和細(xì)胞浸潤能力。在低表達(dá)Nodal分子的低浸潤性膠質(zhì)瘤細(xì)胞GBM中上調(diào)Nodal分子表達(dá)會增加MMP-2分泌，增強(qiáng)細(xì)胞浸潤性和增殖能力以及體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)移植瘤小鼠死亡。在高表達(dá)Nodal的高浸潤性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG中，用shNodal抑制Nodal分子表達(dá)會減少M(fèi)MP-2分泌，降低細(xì)胞浸潤性，促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞向星狀細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)，抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長，延長移植瘤小鼠生存期。此外，Nodal還誘導(dǎo)白血病抑制因子LIF和Cripto-1使膠質(zhì)瘤進(jìn)一步惡化。

進(jìn)一步研究表明shNodal可通過抑制VEGF表達(dá)阻止膠質(zhì)瘤血管的發(fā)生［12］。在人膠質(zhì)瘤組織中，Nodal表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)。在人U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，用RNAi抑制內(nèi)源性Nodal表達(dá)可明顯減少細(xì)胞克隆形成和VEGF分泌。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明:抑制U87MG細(xì)胞中的Nodal表達(dá)能夠阻止膠質(zhì)瘤和腫瘤血管生長以及延長小鼠的生存期。Nodal誘導(dǎo)VEGF表達(dá)至少部分通過ERK1/2-HIF-1 alpha介導(dǎo)的信號通路。最近有研究認(rèn)為Nodal通過其受體ALK4和ALK7及Smad3促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87生長［21］。上述研究表明 Nodal可通過促進(jìn)MMP-2分泌和VEGF表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性發(fā)展。

3.5 Nodal分子與前列腺癌 臨床研究發(fā)現(xiàn)Nodal分子在前列腺癌組織中高表達(dá)［22］。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染prepro-Nodal真核表達(dá)質(zhì)?？纱龠M(jìn)前列腺癌細(xì)胞LNCaP在Matrigel和軟瓊脂上的生長［22］。Nodal分子在前列腺干細(xì)胞WPE和癌細(xì)胞DU145、LNCaP和LNCaP-C81中高表達(dá)，而在正常和永生化的前列腺細(xì)胞PREC、RWPE1和RWPE2中不表達(dá)或低表達(dá)。用重組Nodal蛋白可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞PC3細(xì)胞遷移，并且這種作用可被Nodal信號通路抑制劑SB-431542所抑制［23］。這些研究表明Nodal蛋白參與前列腺癌的發(fā)生、增殖和遷移。

3.6 Nodal分子與胰腺癌 Nodal分子表達(dá)也與胰腺癌相關(guān)。Nodal分子在高分化的胰腺癌細(xì)胞中不易檢測到，但在胰腺癌干細(xì)胞和胰腺間質(zhì)來源的星狀細(xì)胞中明顯高表達(dá)［24］。胰腺星狀細(xì)胞是作為胰腺腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的重要組成部分，它為胰腺腫瘤干細(xì)胞營造一個旁分泌微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)胰腺星狀細(xì)胞分泌Nodal促進(jìn)胰腺腫瘤干細(xì)胞球囊的形成和增加腫瘤細(xì)胞的浸潤性［25］，并且抑制Nodal信號通路可抑制胰腺腫瘤干細(xì)胞自我更新能力和體內(nèi)致瘤性，以及增加腫瘤干細(xì)胞移植瘤對化療藥物吉西他濱的敏感性［24］。

4 Nodal分子與腫瘤治療

4.1 抑制Nodal分子表達(dá)對腫瘤治療的影響 在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231移植瘤小鼠模型中，用Nodal分子靶向的Morpholino(MONodal)抑制Nodal分子表達(dá)，明顯降低移植瘤的形成，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［26］。MONodal還可降低黑色素瘤移植瘤小鼠的腫瘤發(fā)生率和抑制腫瘤生長［7］。shNodal抑制浸潤性乳腺癌細(xì)胞中Nodal表達(dá)，明顯降低腫瘤的形成，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［10］。在高表達(dá)Nodal的U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中shNodal在抑制Nodal表達(dá)的同時可抑制腫瘤血管生長、減緩移植瘤生長和延長小鼠生存期［11，12］。用shNodal處理后還可抑制胰腺腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力和體內(nèi)致瘤性，并增加腫瘤干細(xì)胞移植瘤對化療藥物吉西他濱的敏感性［24］。以上研究表明Nodal分子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用，靶向抑制Nodal分子的表達(dá)可減緩腫瘤的進(jìn)展。

4.2 阻斷Nodal通路對腫瘤治療的影響 Lefty-A和-B屬于TGF-β超家族成員，它們是Nodal的天然抑制因子。Lefty-A和-B可與 Nodal直接結(jié)合使Nodal不能與受體結(jié)合從而阻斷 Nodal信號通路［27］。研究表明用人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hESC)來源的Lefty-A和-B可抑制Nodal在黑色素瘤和乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)以及細(xì)胞克隆形成。在黑色素瘤小鼠移植瘤中注射hESC來源的Lefty-A和-B可明顯促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡和降低Ki67的表達(dá)［14］。研究發(fā)現(xiàn)人肝干細(xì)胞(Human liver stem cell，HLSC)通過生成Lefty-A，可抑制Nodal表達(dá)，進(jìn)而抑制 HepG2細(xì)胞的生長和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［28］;而骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrowderived mesenchymal stem cell，MSC)無 Lefty-A 表達(dá)，因而沒有類似的作用。最近研究也發(fā)現(xiàn)Lefty-A可抑制Nodal的促胰腺癌細(xì)胞增殖作用［29］。另外，由于SB-431542可特異性地阻止ATP與NodalⅠ型受體ALK4或ALK7結(jié)合，使NodalⅠ型受體不能引起Smads的磷酸化從而阻斷Nodal信號通路。因此，SB-431542可作為腫瘤治療的候選藥物。上述研究結(jié)果說明利用某些抑制因子阻斷Nodal分子與其受體結(jié)合或阻斷Nodal分子與其受體結(jié)合后的信號通路可抑制腫瘤細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

5 討論和展望

Nodal分子在胚胎發(fā)育過程中有重要作用，一般在成年正常組織中不表達(dá)，而最近發(fā)現(xiàn)Nodal分子在惡性腫瘤中高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中有重要作用。靶向阻斷Nodal分子信號通路，對腫瘤治療具有重要意義。用天然抑制因子、化學(xué)小分子抑制劑、RNA干擾或者特異性單克隆抗體可靶向抑制Nodal信號通路，從而抑制腫瘤的進(jìn)展。研究顯示，Nodal單克隆抗體可減少黑色素瘤血管生成擬態(tài)的形成［29］，降低轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞C81-61在小鼠移植瘤中轉(zhuǎn)移到肺的能力［5］。另外，Nodal單克隆抗體明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡［20］。但是Nodal分子在腫瘤中的治療作用仍面臨許多問題，如Nodal分子也可能像TGF-β一樣，有雙向調(diào)節(jié)作用，雖然多項(xiàng)研究都認(rèn)為Nodal分子有促腫瘤作用，但也有研究認(rèn)為Nodal分子可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這說明Nodal發(fā)揮不同功能可能與細(xì)胞所處環(huán)境相關(guān)。雖然Nodal分子在多種腫瘤中高表達(dá)，有可能成為一個臨床診斷標(biāo)志分子，但目前還沒有關(guān)于Nodal分子表達(dá)與病人長期預(yù)后分析的報(bào)道，這些問題還有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，Nodal分子與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Nodal分子可成為腫瘤診斷的標(biāo)志分子和腫瘤靶向治療的潛在靶點(diǎn)。

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