酶標(biāo)免疫實(shí)驗(yàn)假陰陽(yáng)性的原因探析

王有美

（平湖市第一人民醫(yī)院，浙江 嘉興 314200）

酶標(biāo)免疫實(shí)驗(yàn)假陰陽(yáng)性的原因探析

王有美

（平湖市第一人民醫(yī)院，浙江 嘉興 314200）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)在過(guò)去的幾十年有了飛速的發(fā)展，一些先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在學(xué)校和醫(yī)學(xué)研究所等地方較為常見，研究酶標(biāo)免疫實(shí)驗(yàn)有助于提高我國(guó)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)。酶標(biāo)免疫是通過(guò)相應(yīng)的特異性抗體對(duì)組織及細(xì)胞中的抗原或半抗原進(jìn)行檢測(cè)。然而，假陰陽(yáng)性是酶標(biāo)免疫實(shí)驗(yàn)中較為常見的現(xiàn)象，分析其產(chǎn)生原因有著重要的意義。本文主要結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，從遇到的假陰陽(yáng)性進(jìn)行分析影響因素，從而提出避免酶標(biāo)免疫實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陰陽(yáng)性的具體措施，為實(shí)際實(shí)驗(yàn)提供參考和指導(dǎo)。

酶標(biāo)免疫實(shí)驗(yàn)；假陰性；假陽(yáng)性；原因；改善措施

隨著現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的普遍使用，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)能夠更好的為醫(yī)院、學(xué)校和科研單位提供服務(wù)[1]。酶標(biāo)免疫實(shí)驗(yàn)在實(shí)際中有著廣泛的應(yīng)用，屬于較為常見的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)，它在病理診斷時(shí)起到重要輔助作用[2,3]。檢測(cè)過(guò)程中每一步的規(guī)范直接關(guān)系到到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而在某些程度影響到病理常規(guī)診斷，這就要求酶標(biāo)免疫實(shí)驗(yàn)做到嚴(yán)格的規(guī)范，防止出現(xiàn)不準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果[4]。假陰性和假陽(yáng)性是酶標(biāo)免疫試驗(yàn)檢測(cè)中最容易出現(xiàn)的現(xiàn)象，直接影響了酶標(biāo)免疫試驗(yàn)檢測(cè)準(zhǔn)確性[5]。本文主要分析了酶標(biāo)免疫實(shí)驗(yàn)中影響假陰陽(yáng)性的因素，并結(jié)合實(shí)際工程分析了改善措施，為實(shí)際酶標(biāo)免疫試驗(yàn)檢測(cè)提供指導(dǎo)，提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)水平。

1 酶標(biāo)免疫試驗(yàn)檢測(cè)假陰陽(yáng)性原因分析及改善措施

假陰陽(yáng)性現(xiàn)象在酶標(biāo)免疫試驗(yàn)檢測(cè)中是一個(gè)綜合現(xiàn)象，該現(xiàn)象不僅與實(shí)驗(yàn)操作有關(guān)，而且與涉及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的各個(gè)細(xì)節(jié)都有影響，在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中較為常見。

1.1 手術(shù)標(biāo)本固定是否充分

標(biāo)本在送來(lái)時(shí)馬上對(duì)標(biāo)本所在腫瘤位子剖開，讓固定液能夠充分滲透到組織中去，以保證組織中抗原不被丟失，而且固定液最好用中性福爾馬林（研究表明中性福爾馬林能夠最大程度的保存組織中的抗原），若組織固定的不好，有些組織切片本身抗原含量低的時(shí)候，檢測(cè)結(jié)果就有可能顯示假陰性的結(jié)果，因此組織的固定是前提條件，它在酶標(biāo)免疫試驗(yàn)過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。

1.2 組織修復(fù)是否恰當(dāng)

首先要選擇什么抗原修復(fù)液是關(guān)鍵，組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；一般像細(xì)胞質(zhì)著色的抗體就用檸檬酸修復(fù)即可，細(xì)胞核/膜著色的抗體用EDTA修復(fù)，但主要還要看實(shí)際情況，比如有時(shí)候試劑的效價(jià)低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)修復(fù)時(shí)間或者改用EDTA修復(fù)來(lái)改善，通常情況下用微波爐修復(fù)是最方便和節(jié)約試劑的，這也是大多數(shù)研究單位首選方式，先用高火10 min，再轉(zhuǎn)中火10 min，同時(shí)修復(fù)時(shí)必須保證溫度始終達(dá)到98 ℃以上（實(shí)驗(yàn)時(shí)必需保證所用微波爐能夠達(dá)到所需溫度），修復(fù)結(jié)束后置于常溫下自然冷卻；經(jīng)過(guò)我多年反復(fù)實(shí)驗(yàn)，我發(fā)現(xiàn)微波修復(fù)過(guò)程中修復(fù)液容易因?yàn)槌掷m(xù)高溫而往外崩，這樣容易導(dǎo)致組織片浸不到試劑而暴露在外，就會(huì)導(dǎo)致掉片、組織背景出現(xiàn)非特異性著色、該著色的部位假陰性等等一系列問(wèn)題，因此我建議用高壓修復(fù)最佳，這樣就會(huì)避免以上出現(xiàn)的問(wèn)題，而且修復(fù)時(shí)溫度始終達(dá)到100 ℃效果更佳。

1.3 動(dòng)物免疫血清及過(guò)氧化氫的封閉

在組織中非特異性染色是常有的現(xiàn)象，這需要通過(guò)動(dòng)物免疫血清來(lái)封閉，一般10～30 min，但是可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果，如組織中含較多血細(xì)胞（肝脹、腎等組織）就要通過(guò)過(guò)氧化氫來(lái)滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶以降低背景染色。

1.4 組織的清洗過(guò)程

實(shí)驗(yàn)時(shí)，一抗和二抗的清洗也很重要，PBS清洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，因此以PBS清洗不斷地延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù)來(lái)保證清洗干凈，而且最好采用沖洗的方式以避免浸洗時(shí)多種抗體交叉結(jié)合，造成非特異性染色。

1.5 使用試劑和蒸餾水

在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中抗體是最重要兩個(gè)原因之一，其濃度和質(zhì)量必需得到首要保證，一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體。現(xiàn)在試劑公司的一抗有即用型和濃縮型，即用型一抗因?yàn)樵噭┑臅r(shí)間和濃度的限制不能調(diào)節(jié)，所以現(xiàn)在濃縮型抗體為首要選擇，使用時(shí)要根據(jù)抗體的效價(jià)及有效期來(lái)調(diào)整抗體的稀釋度，當(dāng)然，不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最佳濃度；實(shí)驗(yàn)時(shí)二抗要選擇與一抗來(lái)源一致的型號(hào)，一般情況下選廣譜二抗，這樣單克隆及多克隆一抗都適用，再者實(shí)驗(yàn)時(shí)所有試劑都要用蒸餾水來(lái)配置，以避免普通水的pH值及其當(dāng)中雜質(zhì)的影響，造成非特異性染色。

1.6 DAB顯色劑的使用

DAB孵育時(shí)間要恰當(dāng)，過(guò)長(zhǎng)會(huì)使片子整個(gè)背景都著色而出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況，過(guò)短DAB與鏈接酶之間結(jié)合不充分，會(huì)出現(xiàn)假陰性的情況，一般顯色時(shí)間控制在8～10 min，但是也要根據(jù)具體組織片來(lái)判斷，因此在顯色時(shí)最好在顯微鏡下操作，這樣能更好掌控顯色的程度；在配置DAB時(shí)，不是濃度越濃越好，DAB原液與過(guò)氧化氫液要1∶1的比例才最佳，以前實(shí)驗(yàn)經(jīng)常有這樣的錯(cuò)誤的認(rèn)知，認(rèn)為DAB原液的比例越高越好，其實(shí)不然，DAB原液的濃度過(guò)于的高于過(guò)氧化氫的濃度反而會(huì)使組織著色變?nèi)?，從而影響結(jié)果判斷。

1.7 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及組織孵育時(shí)間的掌控

酶標(biāo)免疫組化要求實(shí)驗(yàn)室環(huán)境非常嚴(yán)格，組織必須在恒溫37 ℃，濕度合適的環(huán)境下進(jìn)行，一般情況下一抗、二抗的孵育時(shí)間分別為1 h和30 min，不過(guò)經(jīng)過(guò)不斷的實(shí)驗(yàn)和總結(jié)，我建議一抗4 ℃孵育過(guò)夜，這樣能使組合織中的抗原與抗體充分結(jié)合，而得到最佳顯色效果，在實(shí)驗(yàn)室整個(gè)操作過(guò)程中要保證組織不要干片，所以在一抗4 ℃孵育過(guò)夜時(shí)，必須要用專用的薄膜蓋在組織片上，保證試劑長(zhǎng)時(shí)間在4 ℃低溫下不干片，要不然會(huì)出現(xiàn)組織的非特異性染色。抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色，這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是很重要。

2 總 結(jié)

以上原因，都是針對(duì)實(shí)際中常見原因來(lái)進(jìn)行分析的，前提是排除操作者的操作錯(cuò)誤而引起假陰陽(yáng)性結(jié)果，這就需要新手還是要設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照以排除方法的問(wèn)題。還有抗體稀釋液的pH值過(guò)低及抗體質(zhì)量等其他原因的干擾?？傊氚衙庖呓M化做好，可能每一個(gè)環(huán)節(jié)都很重要，但也存在主次之分，出現(xiàn)問(wèn)題了，需要通過(guò)先排除主要的，再依次排除次要的-這是衡量你對(duì)免疫組化原理掌握與否的關(guān)鍵所在。

實(shí)驗(yàn)中，必須根據(jù)容易導(dǎo)致假陰陽(yáng)性的因素，具體針對(duì)每種因素進(jìn)行分析，改善每種可能引發(fā)假陰陽(yáng)性的操作，從而最大程度的保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[1] 張凈.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)被檢血清的一種非特異性來(lái)源-γ-輻射[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,1988,5(2):55.

[2] 鳳婧,陶傳敏,嚴(yán)可寧,等.ELISA一步夾心法檢測(cè)HBsAg假陰性原因分析[J].華西醫(yī)學(xué), 2008,23(6):1394-1395.

[3] 薛春楊,周建波.ELISA法乙肝兩對(duì)半檢測(cè)影響因素分析和臨床意義[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志, 2011,11(16):3913-3914.

[4] 易金平.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)的影響因素分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2010,7(22):2553.

[5] 杜艷霞.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定操作的體會(huì)[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥, 2009,4(27):139-140.

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