結(jié)核休眠菌的治療及控制策略

甘易玲,郭述良

目前全球結(jié)核病疫情嚴(yán)峻，2011年WHO全球結(jié)核病控制報(bào)告統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全球結(jié)核病例共1 200萬(wàn)，其中僅新發(fā)結(jié)核病達(dá)到880萬(wàn)，死亡病例數(shù)達(dá)140萬(wàn)。世界總?cè)丝谥杏?/3存在潛伏結(jié)核菌 (Latent TB infection，LTBI)感染。結(jié)核病病程遷延、易復(fù)發(fā)，且結(jié)核病復(fù)發(fā)有很高比例為內(nèi)源性復(fù)發(fā)[1]，而LTBI是關(guān)鍵因素，故消除LTBI對(duì)控制結(jié)核病疫情至關(guān)重要。臨床上，目前主要采用長(zhǎng)療程的化療來(lái)徹底清除結(jié)核病患者體內(nèi)的結(jié)核菌，但機(jī)體仍可能有少量休眠菌潛伏下來(lái)，成為以后復(fù)發(fā)的根源，之所以結(jié)核病療程長(zhǎng)，主要是由于潛伏感染的結(jié)核菌長(zhǎng)期處于休眠和不代謝狀態(tài)，只在環(huán)境合適的時(shí)候偶爾繁殖。由于不代謝或代謝十分低下，經(jīng)典的化療藥物失去作用。而目前用于預(yù)防兒童結(jié)核菌感染的卡介苗(BCG)對(duì)LTBI的復(fù)發(fā)沒(méi)有保護(hù)作用[2]，所以對(duì)無(wú)論是否接種過(guò)BCG的LTBI，以后均有復(fù)發(fā)的可能。尤其是合并HIV感染，自身免疫性疾病及器官移植等需要腫瘤壞死因子α(TNF-α)中和療法、長(zhǎng)期大劑量激素等免疫抑制治療的LTBI者，復(fù)發(fā)成活動(dòng)性結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。

根據(jù)潛伏感染時(shí)休眠菌在體內(nèi)的生長(zhǎng)周期，我們將控制結(jié)核休眠菌的方法分為：殺滅潛伏期的結(jié)核菌；阻止休眠菌復(fù)蘇；短時(shí)間集中復(fù)蘇休眠菌后再給予殺滅。

1 殺滅潛伏期的結(jié)核菌

由于體內(nèi)潛伏感染時(shí)大量結(jié)核休眠菌和極少量活動(dòng)菌共存[2]，所以目前臨床主要使用以異煙肼為主的長(zhǎng)療程化療來(lái)殺滅偶爾環(huán)境改善后恢復(fù)代謝的活動(dòng)菌，以其徹底治療結(jié)核病。目前臨床上還沒(méi)有可以直接殺滅結(jié)核休眠菌的藥物，僅有部分可以殺滅休眠菌的藥物正處于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)或臨床試驗(yàn)階段。

1.1直接用藥物殺滅潛伏期的休眠菌

1.1.1硝基類(lèi)藥物 硝基咪唑類(lèi)對(duì)大多數(shù)厭氧菌是有效的，而結(jié)核休眠菌形成因素之一就是逐漸缺氧，Wayne等人研究發(fā)現(xiàn)，雖然甲硝唑不能有效地殺滅結(jié)核活動(dòng)菌，但能有效地殺滅結(jié)核休眠菌，聯(lián)合應(yīng)用甲硝唑和經(jīng)典的抗結(jié)核藥物能有效地殺滅結(jié)核休眠菌，并且作用具有劑量依賴性[3]。目前主要研究的硝基咪唑類(lèi)是PA-824(II期臨床試驗(yàn)中)和OPC-67683(III期臨床試驗(yàn)中)。PA-824對(duì)體內(nèi)異煙肼、利福平及吡嗪酰胺強(qiáng)化治療2月的休眠菌和體外低氧誘導(dǎo)的休眠菌均有強(qiáng)的殺菌能力；OPC-67683對(duì)耐多藥結(jié)核病、HIV+的LTBI均有效，并且可以縮短藥物治療時(shí)間[4-5]。Grosset等人研究200mg/d 的PA-824或OPC-67683均是安全的，殺菌效果分別是0.098 ± 0.072 log(10)/d和0.040 ± 0.056 log(10)/d[6]。Murugasu-Oei等發(fā)現(xiàn)硝基呋喃類(lèi)藥物對(duì)結(jié)核休眠菌也有抗菌作用，且強(qiáng)于硝基咪唑類(lèi)(與甲硝唑相比，硝基呋喃對(duì)結(jié)核休眠菌的抗菌活性高35～250倍)[7]。正處于III期臨床試驗(yàn)中的莫西沙星，發(fā)現(xiàn)其與PA-824聯(lián)合應(yīng)用對(duì)休眠菌也有強(qiáng)的殺滅能力[8]

1.1.2二芳基喹啉類(lèi)藥物 此類(lèi)中，目前研究最清楚的是TMC207，其通過(guò)抑制三磷酸合成酶而阻斷ATP合成，從而影響細(xì)菌能量供應(yīng)達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用，其對(duì)活動(dòng)菌和休眠菌均有殺滅作用，并且其對(duì)耐多藥和泛耐藥結(jié)核菌殺滅作用顯著[8]，目前正處于III期臨床試驗(yàn)中。

1.1.3其他有潛力直接殺滅休眠菌的藥物 在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)有部分藥物或制劑也表現(xiàn)出抗休眠菌的能力。如臨床上主要用于治療低氧實(shí)體腫瘤的絲裂霉素C，對(duì)結(jié)核活動(dòng)菌和休眠菌均有抗菌活性，而對(duì)活動(dòng)菌的抗菌活性明顯高于休眠菌，但與硝基類(lèi)藥物相比，有更低的有效殺菌濃度[9]。屬于三氟拉嗪(鈣調(diào)素拮抗劑)和硫利噠嗪，均是吩噻嗪類(lèi)藥物，前者通過(guò)影響細(xì)菌的DNA加工、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成以及呼吸代謝，抑制生長(zhǎng)期菌、休眠期菌以及多耐藥結(jié)核菌生長(zhǎng)，后者對(duì)體外Wayne和鼠休眠菌模型均有抗菌作用[10-11]。

1.1.4殺滅潛伏期的活動(dòng)菌 目前仍是采用以異煙肼和利福平等藥物聯(lián)合化療來(lái)殺滅潛伏期偶爾繁殖的活動(dòng)菌。

1.2阻止休眠菌復(fù)蘇 體內(nèi)休眠菌在微環(huán)境改善，機(jī)體免疫力低下時(shí)會(huì)自動(dòng)復(fù)蘇，從而發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核病，所以研究者試圖通過(guò)阻止休眠菌的復(fù)蘇，讓結(jié)核菌一直處于休眠狀態(tài)，從而達(dá)到控制結(jié)核發(fā)病的目的。

1.2.1用疫苗阻止休眠菌復(fù)蘇

1.2.1.1疫苗的分類(lèi)及最新研究情況 根據(jù)結(jié)核病程，疫苗可分為：①感染前疫苗；②感染后疫苗；③多階段疫苗；④治療性疫苗。其中①感染前疫苗，如目前唯一被批準(zhǔn)用于預(yù)防結(jié)核病的BCG，盡管其基因組中包含有結(jié)核菌相似的DosR及其調(diào)節(jié)子，但研究發(fā)現(xiàn)其不能用于預(yù)防LTBI的復(fù)發(fā)，即對(duì)潛伏期沒(méi)有保護(hù)性免疫[2]。而目前正處于臨床試驗(yàn)的8項(xiàng)感染前疫苗中，沒(méi)有可以將感染的結(jié)核菌完全清除機(jī)體的疫苗，而僅通過(guò)增強(qiáng)免疫力，提高了機(jī)體本身清除結(jié)核菌的能力，其中一部分結(jié)核菌在高免疫壓力情況下進(jìn)入休眠狀態(tài)與機(jī)體免疫力達(dá)到平衡，而降低活動(dòng)性結(jié)核病的發(fā)病率[12]。但在某種程度上卻增加了LTBI的數(shù)量，未從根本上控制休眠菌。②感染后疫苗。主要是針對(duì)潛伏期休眠菌的疫苗，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)休眠菌的清除能力，但此期結(jié)核菌處于休眠狀態(tài)，不代謝，不僅對(duì)藥物不敏感，對(duì)機(jī)體免疫力也耐受，所以想徹底靠疫苗清除休眠菌很難，僅能通過(guò)增強(qiáng)此期免疫力而阻止休眠菌復(fù)發(fā)，讓其一直休眠[13-14]。③多階段疫苗。因注射感染前疫苗的結(jié)核感染者易發(fā)展成潛伏感染，而潛伏感染又需注射疫苗，所以研究者設(shè)想設(shè)計(jì)一個(gè)疫苗包含針對(duì)這兩個(gè)時(shí)期的具有抗原性的蛋白或其DNA，即多階段疫苗誕生。目前有兩個(gè)多階段疫苗(Hybrid 56 in IC31和ID93 in GLA-SE)均處于I期臨床試驗(yàn)中[15]。即能同時(shí)預(yù)防感染者發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核病，也能通過(guò)產(chǎn)生高免疫壓力阻止?jié)摲聛?lái)的休眠菌復(fù)蘇，從而達(dá)到控制休眠菌的作用。④治療性疫苗。目前有3項(xiàng)治療性疫苗處于臨床試驗(yàn)中，而其中RUTI是唯一一個(gè)包含有潛伏期抗原的疫苗，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其有治療LTBI的潛力，目前已完成對(duì)RUTI 3個(gè)不同劑量(5 μg、25 μg及50 μg)安全性的評(píng)估，同時(shí)也證實(shí)在HIV+免疫力低下人群和HIV-免疫力正常人群中，當(dāng)皮下注射RUTI后機(jī)體均能對(duì)多種抗原產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫。綜合II期臨床試驗(yàn)結(jié)果，最終選擇單次皮下注射25 μg來(lái)進(jìn)一步研究RUTI的有效性和安全性，目前正處于2個(gè)(在印度和南非)III期臨床試驗(yàn)中[16-17]。

1.2.1.2用疫苗控制休眠菌的新觀點(diǎn) 從以上可知，想通過(guò)直接用疫苗殺滅潛伏期的休眠菌是很困難，不現(xiàn)實(shí)的。所以有學(xué)者認(rèn)為，因此時(shí)休眠菌對(duì)免疫抵抗，那么可以通過(guò)先用藥物(如英夫利昔單抗)適當(dāng)降低機(jī)體免疫壓力，改變休眠菌的免疫抵抗，再注射疫苗增強(qiáng)免疫力來(lái)殺滅對(duì)免疫敏感的結(jié)核菌，這樣可能更有效地體現(xiàn)疫苗的價(jià)值，能更好地控制結(jié)核病[15]，此觀點(diǎn)僅是理論上的大膽假設(shè)，還存在實(shí)踐及倫理上的爭(zhēng)議。

1.2.2用化合物阻止休眠菌復(fù)蘇 目前已經(jīng)明確復(fù)蘇促進(jìn)因子(resuscitation promoting factor，Rpf)能復(fù)蘇休眠菌，結(jié)核菌中包含5個(gè)Rpf，其中RpfB是研究最清楚的。Ruggiero和Mylliemngap等證實(shí)了2-nitrophenylthiocyanates(NPT)能通過(guò)與RpfB催化部位結(jié)合而抑制其促?gòu)?fù)蘇活性[18-19]。目前此法僅用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，直接將合成的NPT加入Rpf促使體外休眠菌復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)出抑制Rpf促?gòu)?fù)蘇活性，對(duì)于復(fù)蘇機(jī)制及是否能夠用于抑制體內(nèi)休眠菌復(fù)蘇還有待大量實(shí)驗(yàn)研究。

2 集中主動(dòng)復(fù)蘇休眠菌后再殺滅

2.1通過(guò)復(fù)蘇促進(jìn)因子復(fù)蘇休眠菌后再殺滅 正如前面所敘述的，直接將Rpf蛋白加入含有休眠菌的培養(yǎng)基中，即可促使休眠菌短時(shí)間集中的復(fù)蘇，但研究發(fā)現(xiàn)Rpf可能具有誘導(dǎo)復(fù)蘇和休眠的雙重作用[20]，所以仍需大量實(shí)驗(yàn)來(lái)尋找Rpf的最佳復(fù)蘇濃度。此法所需的純化的Rpf，現(xiàn)在還沒(méi)有可以直接購(gòu)買(mǎi)的商品化制劑，僅來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室的原核表達(dá)，或提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)核菌上清液作為Rpf混合物使用。目前也尚未有報(bào)道將Rpf成功用于復(fù)蘇體內(nèi)休眠菌的研究，所以要利用Rpf復(fù)蘇體內(nèi)休眠菌，還需要研究其給藥效果、劑型、途徑和劑量。

2.2通過(guò)降低免疫力誘導(dǎo)休眠菌復(fù)蘇 在人類(lèi)，僅有5%左右的LTBI者在一生中將復(fù)發(fā)成活動(dòng)性結(jié)核病，但合并有HIV感染、糖尿病及器官移植需免疫抑制劑治療等免疫力低下者，極大的增加了復(fù)發(fā)成活動(dòng)性結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)[13]。所以通過(guò)降低免疫力誘導(dǎo)休眠菌復(fù)蘇是可行的，目前主要有3種方法可降低機(jī)體免疫力：①免疫抑制劑。最常用的是治療自身免疫性疾病的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抑制劑——英夫利昔單抗。通過(guò)抑制TNF-α的作用，降低免疫壓力，不利于肉芽腫的形成和維持，改善休眠菌微環(huán)境而誘導(dǎo)其復(fù)蘇。國(guó)內(nèi)外均報(bào)道在利用英夫利昔單抗治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的過(guò)程中，見(jiàn)多數(shù)LTBI者發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核病。②大劑量糖皮質(zhì)激素。大劑量糖皮質(zhì)激素也是通過(guò)降低TNF-α水平，而減輕免疫壓力。③射線照射。體外用γ射線照射潛伏海分枝桿菌感染的斑馬魚(yú)時(shí)，通過(guò)減少體內(nèi)的免疫細(xì)胞降低宿主免疫力成功誘導(dǎo)了海分枝桿菌休眠菌復(fù)蘇[21]。

通過(guò)以上兩種方法成功誘導(dǎo)休眠菌復(fù)蘇后再給予抗結(jié)核藥物殺滅，時(shí)間短(殺滅生長(zhǎng)期菌的時(shí)間一般是1月)。

綜上所述，通過(guò)直接殺滅潛伏期休眠菌的藥物，有望將殺滅結(jié)核菌化療療程縮短到2月，時(shí)間短，且徹底除菌，是比較理想的治療休眠菌的方法。尤其是TMC207，其對(duì)耐藥結(jié)核菌及泛耐藥結(jié)核菌有較好的殺滅作用。隨著耐藥結(jié)核的日益增加，TMC207更有益于結(jié)核病的控制。但還有待臨床試驗(yàn)的最終結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)新藥在控制休眠菌中的應(yīng)用前景。而采用抗活動(dòng)菌的化療藥物來(lái)殺滅偶爾環(huán)境改善后自動(dòng)復(fù)蘇的休眠菌。因此時(shí)復(fù)蘇依賴于休眠菌環(huán)境的自然改善，時(shí)間長(zhǎng)，易變化，難以規(guī)范用藥，所以還需要其他治療LTBI的方法。而將阻止休眠菌復(fù)蘇的方法，因不能預(yù)測(cè)休眠菌復(fù)蘇時(shí)間，需反復(fù)給予疫苗或藥物，繁瑣，且不能徹底除菌。盡管有部分針對(duì)休眠菌的疫苗正處于臨床試驗(yàn)中，但疫苗面臨一個(gè)極大的考驗(yàn)就是，當(dāng)合并其他微生物感染的LTBI者是否會(huì)影響疫苗的保護(hù)性免疫效果及安全性，比如HIV+的LTBI者，因減少了體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量而影響疫苗的保護(hù)性免疫作用。所以也需要等待進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)疫苗的應(yīng)用價(jià)值。而通過(guò)應(yīng)用Rpf抑制劑阻止休眠菌復(fù)蘇的方法目前僅處于實(shí)驗(yàn)研究階段，想通過(guò)給予化合物來(lái)抑制休眠菌復(fù)蘇，需長(zhǎng)期給藥，否則血液藥物濃度降低后休眠菌又會(huì)在微環(huán)境改善、免疫壓力降低的時(shí)候復(fù)蘇，所以此法不現(xiàn)實(shí)。但可以通過(guò)對(duì)阻止復(fù)蘇機(jī)制研究的不斷深入試圖找到新的治療休眠菌的藥物靶點(diǎn)。而短時(shí)間集中復(fù)蘇休眠菌后再予以殺滅，時(shí)間短，且徹底除菌，是比較理想的方法。目前可成功誘導(dǎo)休眠菌復(fù)蘇的方法是降低免疫力療法，但此方法必須在明確對(duì)象是LTBI患者的前提下給藥，而目前還沒(méi)有診斷LTBI的金標(biāo)準(zhǔn)，所以也需綜合病史、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查等來(lái)綜合判斷。但就單純結(jié)核菌潛伏感染的患者，僅僅為誘導(dǎo)潛伏感染的休眠菌復(fù)蘇而主動(dòng)降低免疫力可能帶來(lái)的弊大于利，是不合理論和倫理的。所以也再次強(qiáng)調(diào)不是每一位LTBI患者均需要治療，一定評(píng)價(jià)不同治療方案帶來(lái)的利與弊。臨床在使用免疫抑制劑或大劑量激素治療其他疾病患者時(shí)，也應(yīng)在用藥前排查有無(wú)LTBI或用藥中密切監(jiān)測(cè)有無(wú)結(jié)核病的表現(xiàn)，做到早診斷，早治療。

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