大孔樹(shù)脂在甘草活性成分分離純化中的應(yīng)用△

程新宇，韓亞男，金燕清，李紅麗，侯俊玲*，王文全

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102)

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)( 2009ZX09308-002)，國(guó)家中醫(yī)藥管理局行業(yè)專項(xiàng)( 201107009-03)

*

侯俊玲，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)，E-mail：mshjl@126.com ；王文全，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，Email：wwq57@126.com

大孔樹(shù)脂在甘草活性成分分離純化中的應(yīng)用△

程新宇1，韓亞男1，金燕清1，李紅麗1，侯俊玲1*，王文全2，3*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102)

甘草為我國(guó)常用藥材，其活性成分的分離純化一直是研究的熱點(diǎn)。本文主要介紹大孔樹(shù)脂在分離純化甘草皂苷類成分、甘草黃酮類成分及甘草多糖中的應(yīng)用，并提出相關(guān)研究建議：加強(qiáng)大孔樹(shù)脂分離純化除甘草酸以外的甘草活性成分的研究；不同類的活性成分通過(guò)一個(gè)大孔樹(shù)脂柱完成分離；大孔樹(shù)脂法與其他分離純化方法聯(lián)用方面的研究；建立相關(guān)的樹(shù)脂分離純化工藝模型的，進(jìn)而指導(dǎo)工業(yè)化生產(chǎn)。

甘草；活性成分；大孔樹(shù)脂；分離純化

大孔樹(shù)脂(macroporoue resins)是一種不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的新型高分子材料，發(fā)展于20世紀(jì)70年代，國(guó)外早期應(yīng)用于廢水處理、醫(yī)藥工業(yè)、化學(xué)工業(yè)等。我國(guó)主要將其用于中草藥化學(xué)成分的分離純化[1]。大孔樹(shù)脂既有相似相容的吸附作用，又有分子篩作用，對(duì)不同的有機(jī)物吸附力不同，進(jìn)而可被一定的洗脫劑分離，達(dá)到分離純化的目的[2]。大孔樹(shù)脂還具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長(zhǎng)、節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)[3]。因而其在中草藥的分離純化中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，如銀杏葉總黃酮醇苷[4]、知母皂苷A3[5]、大黃蒽醌類成分[6]、淫羊藿黃酮[7]及三七葉抗抑郁組分[8]的分離和純化。

甘草是甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥功能[9]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，甘草具有抗炎、保肝、抗病毒、鎮(zhèn)咳、抗菌、抗氧化、抗瘧、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、降糖和抗血小板凝集等活性[10]，其活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)為甘草總皂苷、甘草總黃酮、甘草酸及甘草苷等[11]。本文主要?dú)w納和總結(jié)近年來(lái)科研工作者采用大孔樹(shù)脂對(duì)甘草活性成分進(jìn)行分離純化的研究，為大孔樹(shù)脂在中草藥分離純化中的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 分離純化甘草皂苷類成分

1.1 甘草總皂苷

甘草總皂苷為三萜皂苷類物質(zhì)，是甘草的標(biāo)志性成分，從3種不同來(lái)源的甘草中已發(fā)現(xiàn)20余種皂苷，存在形式多為葡萄糖苷，易溶于水，其苷元多為齊墩果烷型三萜類[12]。甘草總皂苷具有多種生物活性，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗?jié)儭⑾?、抗病毒、抗癌活性[13-14]，在日本將甘草總皂苷用于慢性乙肝臨床治療已經(jīng)有20多年的歷史[15]。

因甘草總皂苷具有良好的活性，近些年來(lái)不斷有關(guān)于將大孔樹(shù)脂法用于甘草總皂苷分離純化的研究報(bào)道。龔行楚等[16]認(rèn)為通過(guò)篩選樹(shù)脂類型，優(yōu)化工藝參數(shù)，利用大孔樹(shù)脂法分離純化皂苷可以達(dá)到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的良好效果。李躍輝等[17]以大孔樹(shù)脂對(duì)甘草總皂苷的吸附率、洗脫率、比吸附量、比洗脫量為考察指標(biāo)，測(cè)定了AB-8、D-101、DM-301型大孔樹(shù)脂，并考察吸附、純化等工藝參數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D-101大孔吸附樹(shù)脂適宜于甘草總皂苷的分離純化，其最佳上樣條件：上樣液濃度為5 mg·mL-1(甘草總皂苷含量)，pH為7，上樣流速為2 BV·h-1(BV樹(shù)脂床體積)；最佳洗脫提取條件：先用2 BV水除雜，再用4 BV、pH為8.0～9.0的50%乙醇以2 BV·h-1的速度進(jìn)行解吸附，可較好制備甘草總皂苷。朱中佳等[18]通過(guò)對(duì)HPD100、HPD300、HPD700、HPD722、D-101型5種樹(shù)脂篩選，發(fā)現(xiàn)HPD300樹(shù)脂適宜純化甘草總皂苷。優(yōu)選出純化工藝：生藥濃度為0.2 g·mL-1的上樣液，5 BV上樣，以6 BV的50%乙醇洗脫并收集濃縮揮干，制備所得的甘草干浸膏中總皂苷含量可達(dá)55.6%，甘草酸含量可達(dá)27.2%，且此工藝簡(jiǎn)單環(huán)保，較適合大工業(yè)生產(chǎn)。袁懷波等[19]對(duì)比6種大孔樹(shù)脂吸附純化甘草總?cè)扑岬男阅埽l(fā)現(xiàn)AB-8樹(shù)脂較其他5種樹(shù)脂較優(yōu)。對(duì)AB-8樹(shù)脂進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn)，上樣液pH為5時(shí)其吸附甘草總皂苷能力較優(yōu)，當(dāng)洗脫劑為70%乙醇溶液時(shí)，產(chǎn)品中總皂苷純度可達(dá)72.85%。高雪巖等[20]采用HPD400型大孔樹(shù)脂，以30%乙醇溶液除雜，50%乙醇溶液洗脫得到總皂苷部分，經(jīng)藥理學(xué)驗(yàn)證表明，所得部分對(duì)CCI4致小鼠急性肝損傷和DL乙硫氨酸致小鼠急性脂肪肝具有一定的保護(hù)作用。說(shuō)明利用大孔樹(shù)脂富集純化后的總皂苷部位有較好的活性，在預(yù)防和治療各類肝病和保肝方面值得進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。

1.2 甘草酸

甘草酸(glycyrrhizic acid)是甘草皂苷類成分之一，是甘草的主要活性物質(zhì)。其分子結(jié)構(gòu)包括1分子甘草次酸及2分子葡萄糖醛酸，有2種立體異構(gòu)體，分別是18α和18β[21]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)甘草酸具有多種藥理活性，如抗病毒作用、抗炎保肝活性、抗腫瘤作用、解毒作用。甘草酸及其鹽還有抗痙攣?zhàn)饔?、神?jīng)保護(hù)作用、與其他藥物協(xié)同抗哮喘作用及抗結(jié)核作用等[22]。因此，如何大量地從甘草中制備甘草酸成為研究關(guān)注的焦點(diǎn)，其中不乏關(guān)于利用大孔樹(shù)脂法制備甘草酸的研究。

郭永誼等[23]利用大孔樹(shù)脂法純化甘草酸粗品(甘草酸含量28.99%)，考察了2001-5、D141、D130、HPD-600、HPD-100型5種大孔吸附樹(shù)脂，以甘草酸收率、純度作為考察指標(biāo)，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并篩選出了最佳純化工藝：采用HPD-600型大孔樹(shù)脂，上樣溶液的甘草酸濃度10 mg·mL-1，pH值6.2，吸附流速2 BV·h-1，用60%乙醇洗脫，制備物中甘草酸純度可達(dá)95.02%。高宏等[24]通過(guò)正交試驗(yàn)法篩選出AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)甘草酸的最佳動(dòng)態(tài)吸附及解吸條件，即上柱液濃度為0.5 g·mL-1，柱徑高比為1∶8，最佳上樣流速為2 mL·min-1，采用30%的乙醇溶液除雜質(zhì)，80%的乙醇溶液可以較好地洗脫下甘草酸。

此外，有研究人員將大孔樹(shù)脂法與其他方法結(jié)合以達(dá)到提取純化甘草酸的目的。宋麗軍等[25]在AB-8型大孔樹(shù)脂純化甘草酸工藝研究基礎(chǔ)上，用HPLC監(jiān)控流分的成分變化，優(yōu)化了分離純化方案，達(dá)到去除甘草提取物中甘草苷及其他雜質(zhì)的目的，將甘草酸純度由26.3%提高到35.8%。孫嘯濤等[26]利用HPLC評(píng)價(jià)大孔樹(shù)脂純化甘草酸工藝，以甘草酸廢渣為原料制備甘草酸，結(jié)果顯示AB-8型大孔樹(shù)脂較D201型大孔樹(shù)脂更適于甘草酸的純化，最佳工藝條件：上樣液pH為6.0、甘草廢渣提取液的甘草酸濃度為5.89 mg·mL-1、以50%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，經(jīng)樹(shù)脂純化后的產(chǎn)品的甘草酸純度為52.3%。

此外還有研究人員將大孔樹(shù)脂與聚酰胺樹(shù)脂進(jìn)行聯(lián)合使用，如Zheng Y F先利用聚酰胺將甘草提取液中的黃酮類物質(zhì)除去，再用HPD-400大孔樹(shù)脂進(jìn)一步的純化，將甘草酸的純度由11.40%提升到88.95%，且回收率可達(dá)76.53%[27]。

1.3 甘草次酸

甘草次酸(glycyrrhetinic acid)屬于五環(huán)三萜類化合物，是甘草酸的苷元，甘草的根莖中有發(fā)現(xiàn)，甘草酸水解脫去糖鏈可生成甘草次酸，有18α和18β2種立體異構(gòu)體[28]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)甘草次酸具有一定的防癌和抗癌作用，同時(shí)具有抗病毒感染的作用，對(duì)致癌性的病毒如肝炎病毒、EB病毒及艾滋病病毒的感染具有抑制作用[29]，因此對(duì)其的研究越發(fā)引人矚目。

目前關(guān)于利用大孔樹(shù)脂分離純化甘草次酸的報(bào)道較少，曾啟華[30]采用水酸提取法從甘草中提取得到甘草酸粗品，用D101大孔樹(shù)脂進(jìn)行甘草酸的純化，然后將甘草進(jìn)行酸性加壓水解得到甘草次酸。

2 分離純化甘草黃酮類物質(zhì)

2.1 甘草總黃酮

甘草總黃酮是甘草中一類重要的活性物質(zhì)，目前已經(jīng)從甘草中發(fā)現(xiàn)300多種黃酮類化合物，在藥理活性研究中發(fā)現(xiàn)甘草總黃酮具有抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、激素樣作用、降糖、降脂、抗癌、解痙、抗抑郁等作用。臨床上用于各類炎癥、急慢性肝損傷、腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)退化性疾病等的治療[12]。

李紅等[31]評(píng)測(cè)了AB-8、S-8、NKA、NKA-Ⅱ、D4020、D201、XDA-1、X-5型等大孔樹(shù)脂對(duì)甘草黃酮的吸附和解吸附的能力，發(fā)現(xiàn)XDA-1型大孔樹(shù)脂對(duì)甘草黃酮的動(dòng)態(tài)吸附率為92.18%，動(dòng)態(tài)解吸率為83.73%，對(duì)甘草黃酮類物質(zhì)的選擇性較其他樹(shù)脂好。傅博強(qiáng)等[32]優(yōu)化了XDA-1分離純化甘草黃酮的工藝，所收集的甘草黃酮部分不含有甘草酸，其優(yōu)化條件為：上樣液pH為5，甘草酸濃度為1.5 mg·mL-1，總黃酮濃度為0.75 mg·mL-1，上樣流速為3 BV·h-1，用45%的乙醇1.5 BV·h-1洗脫，總黃酮收率為69.7%。廉宜君等[33]考察了D101、S-8、AB-8、DML30、HPD300、ADS-7、HPD100、HPD450型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)甘草黃酮的吸附率和解吸率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPD300樹(shù)脂對(duì)甘草黃酮有較好的吸附和解吸附效果。其吸附分離甘草黃酮適宜的條件：上樣液濃度為2.0 mg·mL-1，上樣流速1.5 BV·h-1，上樣量為2 BV；用3 BV 80%乙醇溶液，按1.5 BV·h-1洗脫，制備的黃酮純度是原來(lái)的2倍以上。李杰等[34]優(yōu)化了AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)甘草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附條件，并通過(guò)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行建模，以模擬甘草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附過(guò)程。結(jié)果表明黃酮吸附率可達(dá)93.12%；經(jīng)遺傳算法優(yōu)化的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練后可應(yīng)用于甘草黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附過(guò)程的模擬。呂子明等[35]從12種大孔樹(shù)脂中篩選出AB-8對(duì)甘草總黃酮純化較好，并優(yōu)化了純化工藝，在優(yōu)選條件下，洗脫物中甘草總黃酮純度為38%。

2.2 甘草苷

甘草苷(Liquiritin)是黃酮類化合物中重要的單體活性成分，具有很強(qiáng)的藥理活性，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)甘草苷具有抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)、對(duì)肝臟毒性保護(hù)、對(duì)心臟系統(tǒng)的作用等，以及治療咽炎、急慢性咳嗽和痰多等癥[36]。

魚紅閃等[37]通過(guò)D101型和HP20型大孔樹(shù)脂純化甘草苷粗品，對(duì)甘草苷的最大吸附量分別為238.7 mg·g-1和278.9 mg·g-1，最佳乙醇濃度分別為50%和60%。

2.3 異甘草素

異甘草素(Isoliquiritigenin)是甘草中的一種異黃酮類化合物，有較強(qiáng)的藥理活性。現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)異甘草素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、對(duì)心血管及氣管作用以及抗艾滋病等作用[38]。

付玉杰等[39]從HPD-600、D4020、D101、AB-8、NKA-II、AL-2和NKA-9中篩選出AB-8對(duì)異甘草素有較好的吸附與解吸附作用，利于異甘草素的分離純化。其最佳的吸附與解附條件為：在室溫下，以1.2 BV·h-1的流速上樣，上樣量為5 BV，且上樣液pH為5，再用70%的乙醇溶液，在1 BV·h-1的流速下洗脫4.5 BV，最后得到的異甘草素的純度由2.02%提高至29.1%，較處理前提高14.4倍。趙文灝等[40]通過(guò)對(duì)比AB-8、D101、Al-2、NKA-2型4種樹(shù)脂，同樣篩選出AB-8較適宜于異甘草素的富集純化，并發(fā)現(xiàn)AB-8在吸附異甘草素時(shí)是個(gè)吸熱過(guò)程，且在15～40 ℃吸附量隨溫度升高而增加，50%乙醇溶液洗脫得到產(chǎn)品，異甘草素含量為26%，回收率為33%。

2.4 光甘草定

光甘草定(Glabridin)為脂溶性黃酮類成分，存在于光果甘草的根及根莖，是光果甘草的特有成分，占甘草總黃酮含量的11%[41]。藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制黑色素形成作用、抗動(dòng)脈粥樣硬化和降血脂作用、神經(jīng)保護(hù)和增強(qiáng)記憶作用、雌激素樣活性、抑菌作用[42]，因其具有的抗氧化、抑制黑色素形成的作用顯著，在化妝品和醫(yī)療保健美容等領(lǐng)域，受到廣泛的關(guān)注[43]。此外還有報(bào)道稱，光甘草定或光甘草素具有抑制齲齒的作用[44]。

敖明章等[45]利用D101型大孔樹(shù)脂分離純化光甘草定，發(fā)現(xiàn)利用4 BV的90%的乙醇溶液，以3 BV·h-1的流速進(jìn)行洗脫可以很好地將光甘草定洗脫下來(lái)，且洗脫物中光甘草定的含量達(dá)45%，回收率為67.79%。呂姣[46]聯(lián)合使用了HPD100和AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)光甘草定進(jìn)行純化，首先用HPD100大孔吸附樹(shù)脂純化光甘草定，以30%乙醇溶液作為光甘草定的上樣溶液(0.5～0.6 mg·mL-1)，洗脫液體積8 BV，40%乙醇除雜，再以70%乙醇洗脫收集光甘草定，產(chǎn)品的純度為23.90%；為提高光甘草定的純度，再以AB-8大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)一步純化，產(chǎn)品純度提高至35.10%。

盡管光甘草定有著很好的活性，但目前對(duì)于其提取純化的研究并不多，利用大孔樹(shù)脂分離純化光甘草定有待進(jìn)一步研究。

3 分離純化甘草多糖

甘草多糖( Glycyrrhiza polysaccharide，GPS)主要由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖組成。目前研究發(fā)現(xiàn)其有多種藥理活性，如抗炎[47]、抑菌[48]、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤[49]等。

黃申等[50]從LSA-5B、D4020、D201、AB-8、S-8、XDA-I、NKA、NKA-II、X-5型9種大孔吸附樹(shù)脂中，篩選出LSA-5B適宜于甘草多糖的分離純化，其對(duì)甘草多糖的動(dòng)態(tài)吸附率為56%，動(dòng)態(tài)解吸率為99%。吳玉和[51]利用D301T和S-8除去多糖中的蛋白，色素含量顯著降低，并用自制的纖維素基大孔樹(shù)脂和聚乙烯醇基大孔樹(shù)脂對(duì)甘草多糖進(jìn)行純化，且純化效果明顯好于傳統(tǒng)的脫蛋白方法sevag法、三氯乙酸法及活性炭法。

4 討論

甘草皂苷類、黃酮類成分及甘草多糖是甘草的主要活性成分，藥理活性的不斷深入研究增加了它們的市場(chǎng)需求。同時(shí)，隨著綠色環(huán)保理念的不斷深入，那些危害環(huán)境的傳統(tǒng)分離純化工藝已經(jīng)不能滿足社會(huì)的需要，大孔樹(shù)脂法可以很好地替代傳統(tǒng)分離純化方法。此外，與聚酰胺法、膜分離法、泡沫分離法、高速逆流色譜法、雙水相體系法、模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)等多種新技術(shù)相比，大孔吸附樹(shù)脂法具有工藝簡(jiǎn)單、成本低、無(wú)污染、效率高等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大孔樹(shù)脂法是目前常用的純化方法之一，已被廣泛應(yīng)用于皂苷類、黃酮類、苷類和生物堿類等各種化學(xué)成分的分離、富集，是適用于工業(yè)化的工藝之一。

然而，大孔吸附樹(shù)脂法目前主要用于甘草酸的分離純化，而針對(duì)甘草中總黃酮和多糖兩類有效部位及其單體的分離純化研究較少，如甘草苷、光甘草定、甘草查耳酮A、甘草查耳酮等。這些單體及有效部位隨著藥理活性的不斷研究必將得到廣泛使用，因此，有必要加強(qiáng)大孔樹(shù)脂法在除甘草酸以外的甘草活性成分的分離純化研究。此外，雖然大孔樹(shù)脂法在甘草酸上應(yīng)用廣泛，但是這都是只針對(duì)單一成分，往往在分離純化甘草酸的同時(shí)，造成了其他活性成分的浪費(fèi)。如何在一個(gè)大孔樹(shù)脂分離純化工藝中將主要的活性成分，如甘草總皂苷、甘草總黃酮及甘草多糖等依此分離純化，在保護(hù)環(huán)境的同時(shí)做到物盡其用，筆者認(rèn)為值得深入研究。另外，目前在甘草活性物質(zhì)提取中應(yīng)用的樹(shù)脂類型不統(tǒng)一，在生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)因重復(fù)性試驗(yàn)而造成浪費(fèi)；為取得最好的效果，應(yīng)從樹(shù)脂的篩選、吸附量、解吸量及吸附動(dòng)力學(xué)等方面進(jìn)行深入研究，建立分離純化模型，進(jìn)而找到最佳分離純化工藝。最后，對(duì)于大孔樹(shù)脂富集物的純度一般較低，可以考慮樹(shù)脂聯(lián)用，或者和聚酰胺等樹(shù)脂結(jié)合使用等。在這方面已有甘草酸的分離純化報(bào)道[27]，但是在甘草的其他活性成分研究方面應(yīng)用較少，因此作者認(rèn)為大孔樹(shù)脂與其分離純化方法聯(lián)合使用也有待深入研究。

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ProgressofApplicationofMacroporousResininSeparationandPurificationofGlycyrrhizauralensisActiveIngredient

CHENGXinyu1,HANYanan1,JINYanqing1,LIHongli1,HOUJunling1*,WANGWenquan2,3*

(1.InstituteoftraditionalChinesemedicine(TCM),BeijinguniversityofChinesemedicine,Beijing100102，China; 2.Instituteofmedicinalplants,Chineseacademyofmedicalsciences,Pekingunionmedicalcollege,Beijing100193,China;3.LabofEngineeringResearchCenterofGAPforChineseCrudeDrugs,MinistryofEducation,Beijing100102,China)

The roots ofGlycyrrhizauralensisare widely used in Chinese medicine,and the separation and purification of the active ingredient has been a research focus.This paper focus on：1.Betterly use macroporous resin in purifing active ingredients fromGlycyrrhizauralensisexcept glycyrrhizic acid.2.Different kinds of active ingredients through a macroporous resin column separation.3.Macroporous resin method combination with other methods to separate and purify.4.Establish a macroporous resin purification process model to guide industrial production.

Glycyrrhizauralensis;Active ingredients;Macroporous resin;Separation and purification

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.022

2013-10-11)