重慶單中心2009至2011年急性呼吸道感染住院患兒2種甲型流感病毒檢出情況及臨床特征分析

謝曉虹 金 玲 彭才靜 王麗佳 鄧 昱 劉恩梅

·論著·

重慶單中心2009至2011年急性呼吸道感染住院患兒2種甲型流感病毒檢出情況及臨床特征分析

謝曉虹 金 玲 彭才靜 王麗佳 鄧 昱 劉恩梅

目的 了解重慶地區(qū)急性呼吸道感染住院患兒新型甲型H1N1流感病毒(S-OIVs)與季節(jié)性甲型流感病毒(IVA)檢出情況及臨床特征。方法 收集2009年6月至2011年5月重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院呼吸科急性呼吸道感染住院患兒鼻咽抽吸物(NPA)，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測S-OIVs和季節(jié)性IVA基因組RNA，分析流行特點和臨床特征，并采用Logistic回歸分析急性呼吸道感染進展為重癥肺炎的危險因素。結(jié)果 共收集NPA標本1 074份，經(jīng)PCR檢測IVA陽性105份(9.8%)，其中1.4%(15/1 074)為S-OIVs，8.4%(90/1 074)為季節(jié)性IVA。2種病毒陽性病例男女比例、年齡分布和平均住院天數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。①S-OIVs在2009年夏季高發(fā)(11/15,73.3%)，季節(jié)性IVA在2009年夏季(26/95,27.4%)、2010年夏季(22/95,23.2%)和2011年春季(25/95,26.3%)檢出率明顯高于其他各季節(jié)。②2種病毒陽性患兒臨床癥狀、外周血WBC計數(shù)、CRP水平相當，S-OIVs陽性患兒重癥毛細支氣管炎1例(6.7%)，季節(jié)性IVA陽性患兒重癥肺炎14例(15.6%)。③15份S-OIVs陽性標本中，單純S-OIVs感染3份，合并其他病毒感染9份，痰培養(yǎng)陽性7份。90份季節(jié)性IVA陽性標本中，單純季節(jié)性IVA感染21份，合并其他病毒感染42份，痰培養(yǎng)陽性10份。④心臟基礎(chǔ)疾病(OR=13.60)、發(fā)生喘息(OR=6.82)和合并腺病毒感染(OR=6.21)為季節(jié)性IVA感染患兒進展為重癥肺炎的危險因素。結(jié)論 重慶單中心急性呼吸道感染住院患兒S-OIVs檢出率低于季節(jié)性IVA。S-OIVs和季節(jié)性IVA感染患兒均以下呼吸道感染為主。心臟基礎(chǔ)疾病、喘息癥狀和合并腺病毒感染有可能是季節(jié)性IVA感染患兒進展為重癥肺炎的危險因素。

新型甲型H1N1流感病毒； 季節(jié)性甲型流感病毒； 兒童； 急性呼吸道感染

流感病毒根據(jù)病毒基質(zhì)蛋白分為甲(A)、乙(B)、丙(C)3型，其中以甲型流感病毒(IVA)最常見[1]。目前，IVA根據(jù)病毒包膜表面的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性,分為16種HA(H1～16)和9種NA(N1～9)[2]。IVA表現(xiàn)出周期性、季節(jié)性和區(qū)域性的特點，1918至1919年在歐洲大流行的西班牙流感病毒為H1N1亞型，是現(xiàn)在人群中流行的所有IVA的起源病毒。近半世紀以來，季節(jié)性IVA以H3N2亞型為主，也有H1N1亞型。2009年墨西哥暴發(fā)人感染甲型H1N1流感病毒株攜帶豬流感病毒、禽流感病毒和人流感病毒3種基因片斷，是發(fā)生基因重排的新型IVA[3]，故被命名為新型甲型H1N1流感病毒(S-OIVs)。流感病毒是兒童呼吸道感染最常見的病毒病原之一，為了解重慶地區(qū)兒童S-OIVs和季節(jié)性IVA的流行情況及感染后臨床特征，本研究采用RT-PCR方法檢測2年重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院(我院)急性呼吸道感染住院患兒鼻咽抽吸物(NPA)的流感病毒表達，結(jié)合患兒臨床資料分析相關(guān)特征，以期提高對兒童S-OIVs和季節(jié)性IVA感染的認識水平。

1 方法

1.1 標本來源 本研究標本來源于2009年6月至2011年5月我院呼吸科住院的急性呼吸道感染患兒的NPA標本。標本采集時間為患兒入院當天，經(jīng)一次性可控式吸痰管插入患兒鼻咽部負壓吸取4管NPA約2 mL，3管標本常規(guī)送檢我院臨床檢驗中心進行痰培養(yǎng)、肺炎支原體和常見病毒熒光檢測；1管標本用于本研究，NPA標本采集后立即置于4℃冰箱，4 h內(nèi)送至我院兒科研究所呼吸實驗室，在超凈臺內(nèi)將NPA常規(guī)離心分裝并按標本收集時間順序編號，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 診斷標準 急性呼吸道感染診斷標準[4]：包括急性上呼吸道感染(鼻炎、咽炎、扁桃體炎、喉炎)和下呼吸道感染(急性支氣管炎、毛細支氣管炎、支氣管肺炎和大葉性肺炎)，根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、X線胸片和實驗室檢查進行診斷。重癥肺炎診斷參照中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組2007年制定的兒童重癥肺炎的診斷標準[5]。

1.3 病原體檢測

1.3.1 RNA提取和總RNA轉(zhuǎn)錄 使用QIAmpMiniElute Virus Spin DNA/RNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)提取患兒NPA標本總RNA，操作按試劑盒說明書進行。使用SuperScript Ⅲ試劑盒(美國Invitrogen公司)將提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作按試劑盒說明書進行。

1.3.2 S-OIVs和季節(jié)性IVA檢測 S-OIVs和IVA引物及探針由美國Invitrogen公司合成。首先合成IVA引物及探針，F(xiàn)orward：5′-AAAGCGAATTTCAGTGTGAT-3′，Reverse：5′-GAAGGCAATGGTGAGATTT-3′；探針：FAM-CCCTCTTCGGT GAAAGCCCT-BHQ1。用Takara一步法熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物公司)進行熒光定量PCR檢測，明確標本為A型而非B型和C型流感病毒(但不能確定HA或NA亞型)。反應(yīng)條件：50℃預變性5 min；95℃變性10 s，95℃退火5 s，55℃延伸20 s，共40個循環(huán)。對IVA陽性標本再用S-OIVs引物及探針通過熒光定量PCR方法檢測是否為S-OIVs陽性，引物、探針序列和方法學詳見文獻[6]。將S-OIVs陽性的PCR擴增產(chǎn)物送重慶醫(yī)科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，用ABI3100DNA測序儀進行DNA測序分析，測序結(jié)果用Chromas軟件進行比對。

1.3.3 其他常見呼吸道病毒檢測 對S-OIVs或季節(jié)性IVA檢測陽性的標本采用多重巢式PCR檢測呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AdV)、副流感病毒(PIV1-4)、冠狀病毒(CoV)和人偏肺病毒(hMPV)，具體方法見文獻[7,8]，采用RT-PCR方法檢測人博卡病毒(HBoV)，具體方法見文獻[9]。

1.3.4 陽性結(jié)果復核 從2009年起，由本課題組成員每月對當月采集的標本統(tǒng)一檢測，至2011年5月后由本文第一作者對所有陽性結(jié)果的標本再行S-OIVs和季節(jié)性IVA復測。

1.4 S-OIVs和IVA陽性病例資料截取 根據(jù)NPA標本號對應(yīng)的住院號查找病歷，截取如下資料用于本文分析：①一般情況：性別、年齡、出生史；②臨床資料：臨床癥狀、體溫、血常規(guī)、CRP、痰培養(yǎng)、肺炎支原體檢測結(jié)果和診斷；③根據(jù)標本送檢時間： 3～5月定義為春季，6～8月為夏季，9～11月為秋季，12月至次年2月為冬季。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 NPA標本共1 074份，經(jīng)PCR檢測IVA陽性105份(9.8%)，男74例(70.5%)，女31例。其中，15/105(14.3%)份為S-OIVs陽性，90/105(85.7%)份為季節(jié)性IVA陽性，陽性標本復核結(jié)果與首次檢測一致。S-OIVs和季節(jié)性IVA陽性病例一般情況見表1，在男女比例、年齡分布和平均住院天數(shù)上差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2種病毒陽性檢出率2歲以下的兒童高于2歲以上兒童(S-OIVs：73.3%vs27.6%,P=0.027;季節(jié)性IVA:76.0%vs23.4%,P<0.001)

Notes S-OIVs: swine-origin influenza A H1N1 virus; IVA: influenza virus A

2.2 S-OIVs和季節(jié)性IVA季節(jié)分布 如圖1所示，S-OIVs在2009年夏季高發(fā)(11/15,73.3%)，而季節(jié)性IVA在2009年夏季(26/95,27.4%)、2010年夏季(22/95,23.2%)和2011年春季(25/95,26.3%)檢出率高于其他各季節(jié)。2種病毒在2009年和2010年秋冬季的檢出率均低于其他各季節(jié)。

圖1 2009年6月至2011年5月不同季節(jié)新型甲型H1N1流感病毒和季節(jié)性流感病毒檢出情況

Fig 1 Detection of swine-origin influenza AH1N1 virus and influenza virus A in different seasons from June 2009 to May 2011

Notes S-OIVs: swine-origin influenza A H1N1 virus; IVA: influenza virus A

2.3 S-OIVs和季節(jié)性IVA感染病例的臨床特征 15例S-OIVs陽性患兒中，咳嗽15例，發(fā)熱9例，喘息5例，腹瀉4例，呼吸困難1例；體溫平均峰值(39.2±0.2)℃；發(fā)生腹瀉4例患兒年齡(8.5±2.3)個月。1例外周血WBC>15×109·L-1，2例CRP升高。下呼吸道感染14例，其中肺炎10例，毛細支氣管炎3例(包括重癥毛細支氣管炎1例)，支氣管炎1例；上呼吸道感染1例。

90例季節(jié)性IVA陽性患兒中，咳嗽84例，發(fā)熱63例，喘息42例，腹瀉29例，呼吸困難14例；體溫平均峰值(38.9±0.1)℃；發(fā)生腹瀉29例患兒年齡(5.6±0.8)個月。7例外周血WBC>15×109·L-1，9例CRP≥8 mg·L-1。下呼吸道感染82例，其中肺炎70例(包括重癥肺炎14例)，毛細支氣管炎7例，支氣管炎5例；上呼吸道感染8例，包括急性感染性喉炎2例。

S-OIVs和季節(jié)性IVA陽性患兒臨床癥狀、外周血WBC計數(shù)、CRP水平相當。

2.4 其他呼吸道病原學檢測情況 15份S-OIVs陽性標本中，單純S-OIVs感染3份(20.0%)；合并其他病毒感染9份(60.0%)，其中PIV3 5份，Adv 2份，RSV、hMPV和PIV4各1份；痰培養(yǎng)陽性7份(46.7%)，其中肺炎鏈球菌4份，肺炎克雷伯菌肺炎亞種、溶血葡萄球菌、陰溝腸桿菌和流感嗜血桿菌各1份。肺炎支原體PCR檢測陽性4份(26.7%)。1例重癥毛細支氣管炎患兒的病原學檢查結(jié)果為S-OIVs+AdV。

90例季節(jié)性IVA陽性標本中，單純季節(jié)性IVA感染21份(23.3%)；合并其他病毒感染42份(46.7%)，其中PIV3 18份、RSV 19份、HBoV 7份、AdV 9份、PIV1 5份、CoV 4份，hMPV 2份、PIV2和PIV4各1份；痰培養(yǎng)陽性47份(52.2%)，其中肺炎鏈球菌18份，流感嗜血桿菌11份，大腸埃希菌8份，肺炎克雷伯菌肺炎亞種6份，卡他莫拉菌3份，金黃色葡萄球菌3份，副流感嗜血桿菌2份。14例重癥肺炎患兒標本中，單純季節(jié)性IVA感染1份；合并其他病毒感染10份(71.4%)，其中RSV 5份，PIV3、ADV各4份，HBoV、PIV4和PIV1各1份；痰培養(yǎng)陽性10份，其中肺炎鏈球菌3份，流感嗜血桿菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌肺炎亞種各2份，黏質(zhì)沙雷菌和產(chǎn)氣腸桿菌各1份。

2.5 S-OIVs和季節(jié)性IVA重癥肺炎危險因素 15份S-OIVs陽性病例中，僅1例(6.7%)診斷為重癥毛細支氣管炎，故未統(tǒng)計分析重癥和非重癥呼吸感染患兒相關(guān)數(shù)據(jù)。90例季節(jié)性IVA陽性病例中，14例診斷為重癥肺炎，如表2所示，重癥肺炎患兒合并心臟基礎(chǔ)疾病、發(fā)生喘息、合并AdV陽性比例均顯著高于非重癥呼吸道感染患兒，進一步行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示心臟基礎(chǔ)疾病、喘息癥狀與合并AdV感染是季節(jié)性IVA患兒進展為重癥肺炎的危險因素，但95%CI范圍很寬(表3)。

Notes IVA: influenza virus A; PIV: parainfluenza virus; RSV: respiratory syncytial virus; AdV: adenovirus;Sp:Streptococcuspneumonia; RTI: respiratory tract infection

表3 季節(jié)性流感病毒陽性患兒發(fā)展為重癥肺炎危險因素的Logistic回歸分析

Tab 3 Multivariable logistic regression analysis of severe pneumonia development with positive detection of seasonal influenza virus A

Notes AdV: adenovirus

3 討論

本研究對2009年S-OIVs暴發(fā)后2年間我院急性呼吸道感染住院患兒的1 074份NPA標本進行S-OIVs和季節(jié)性IVA檢測，結(jié)果顯示S-OIVs陽性率為1.4%，低于季節(jié)性IVA(8.4%)，提示該時間段重慶地區(qū)兒童人群爆發(fā)S-OIVs疫情可能性不大。S-OIVs和季節(jié)性IVA患兒年齡分布相似： S-OIVs陽性標本中≤5歲14/15份(93.3%)，0～2歲11/15份(73.3%)；季節(jié)性IVA陽性標本中≤5歲83/90份(92.2%)，0～2歲69/90份(76.7%)，提示重慶地區(qū)<5歲兒童特別是2歲以下嬰幼兒為S-OIVs和季節(jié)性IVA高發(fā)人群，與文獻報道一致[10]，可能與嬰幼兒呼吸系統(tǒng)發(fā)育不成熟，特異性和非特異性免疫應(yīng)答低下有關(guān)。有研究報道[11]S-OIVs高發(fā)人群包括學齡前期兒童，但多伴有急性白血病、腎病綜合征等基礎(chǔ)疾病，這部分患兒未在本文納入范圍內(nèi)。

關(guān)于IVA流行的季節(jié)性，中國北方地區(qū)流行高峰為12月或次年1月，南方地區(qū)則為4、5、7、8、11和12月[12]。本組資料顯示，重慶地區(qū)S-OIVs流行高峰以2009年夏季為主，僅有1個高峰，加拿大在2009年有2個流行高峰(春季和秋季)[13]；而季節(jié)性IVA流行高峰為夏春季，以夏季最為活躍，S-OIVs和季節(jié)性IVA均于秋冬季逐漸回落。這些流行特點與當季的氣候變化、人群免疫狀態(tài)等有關(guān)。

本組資料顯示S-OIVs和季節(jié)性IVA引起兒童呼吸道感染住院的最常見診斷均為肺炎，臨床表現(xiàn)相似，以咳嗽、發(fā)熱和喘息為主，發(fā)熱以中高熱為主，1歲以下嬰兒易合并腹瀉，但咽痛、肌痛和乏力等主觀癥狀不明顯，與患兒年齡小不能表述有關(guān)；S-OIVs和季節(jié)性IVA感染患兒外周血WBC>15×109·L-18例(7.6%)，CRP≥8 mg·L-111例(10.5%)，提示S-OIVs和季節(jié)性IVA感染一般不引起外周血WBC計數(shù)和CRP升高，但S-OIVs重癥肺炎患兒除外[14]。本文納入的S-OIVs感染患兒未出現(xiàn)2009年甲型H1N1流感臨床病例調(diào)查協(xié)作小組報道的嗜睡、驚厥和意識障礙等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[14]，可能與病毒載量、病情和樣本量有關(guān)。

流感患者合并其他呼吸道病毒感染概率可高達20%[15]，但兒童特別是嬰幼兒的協(xié)同感染情況不完全清楚，本組資料顯示S-OIVs和季節(jié)性IVA合并其他呼吸道病毒感染率分別為80.0%和76.7%，其中以PIV3檢出率最高，這可能與PIV3流行季節(jié)與S-OIVs和季節(jié)性IVA有較大重疊有關(guān)。流感病毒與細菌的關(guān)系也同樣密切，有研究發(fā)現(xiàn)S-OIVs和季節(jié)性IVA感染患者易繼發(fā)細菌(如肺炎鏈球菌)感染[16]，本組105例IVA患兒痰培養(yǎng)肺炎鏈球菌陽性者22例(21.0%)，但其中僅有3例診斷為重癥肺炎，考慮痰培養(yǎng)陽性為呼吸道定植菌可能性較大。

本研究結(jié)果顯示S-OIVs非重癥呼吸道感染患兒臨床表現(xiàn)、痰肺炎鏈球菌的檢出情況與季節(jié)性IVA患兒差異無統(tǒng)計學意義，但文獻報道[17]S-OIVs還可能并發(fā)肺不張、呼吸窘迫綜合征、塑形性支氣管炎等呼吸系統(tǒng)危重癥。本研究中單純S-OIVs感染患兒平均住院天數(shù)最短，S-OIVs感染患兒中僅有1例為重癥毛細支氣管炎，結(jié)合S-OIVs的結(jié)構(gòu)特點：PB2、NS1及PB-F2蛋白位點具備低致病性蛋白結(jié)構(gòu)[18]，推測與高致病性的禽流感病毒相比，S-OIVs可能是低致病力病毒，同時可以解釋S-OIVs重癥病例數(shù)量不占優(yōu)勢的現(xiàn)象。

通過多因素Logstic回歸分析，本研究發(fā)現(xiàn)心臟基礎(chǔ)疾病和發(fā)生喘息有可能是季節(jié)性IVA患兒進展為重癥肺炎的危險因素，提示有心臟基礎(chǔ)疾病的患兒感染季節(jié)性IVA及感染后出現(xiàn)喘息癥狀，需警惕病情進一步加重，同時這類患兒在季節(jié)性IVA流行季節(jié)需根據(jù)情況盡早接種疫苗。另一個可能危險因素為AdV陽性，由于本研究未對AdV進行分型，且7型AdV多導致重癥肺炎，所以不能確定這部分患兒病情是否有7型AdV的參與。但本研究發(fā)現(xiàn)，單純季節(jié)性IVA感染患兒平均住院天數(shù)與單純S-OIVs感染患兒接近，痰檢出其他病原的季節(jié)性IVA感染患兒平均住院時間最長，且季節(jié)性IVA重癥肺炎患兒痰其他病原檢出率有高于普通感染患兒的趨向，一定程度上提示季節(jié)性IVA合并其他病原存在的現(xiàn)象可能是影響患兒病情和治療的重要因素之一。

本研究的不足之處和局限性：①本研究未納入因病情較重由急診科直接收入ICU，或有呼吸道癥狀但可能因合并神經(jīng)、血液等其他系統(tǒng)疾病未收入呼吸科病房的患兒，這部分數(shù)據(jù)的缺失低估了2種病毒所致的重癥病例數(shù)及臨床特征；②季節(jié)性IVA測序未進行亞型分析，不同亞型可能對病情有不同影響；③本研究S-OIVs和季節(jié)性IVA陽性病例樣本量不足，導致季節(jié)性IVA陽性病例進展為重癥肺炎危險因素的95%CI很寬，對危險因素結(jié)果信心不足。

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(本文編輯：張萍)

Comparative analysis of epidemiological and clinical features in hospitalized children with acute respiratory infection caused by novel swine-origin influenza virus and seasonal influenza virus A in Chongqing from 2009 to 2011

XIE Xiao-hong, JIN Ling, PENG Cai-jing, WANG Li-jia, DENG Yu, LIU En-mei

(Children's Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China)

LIU En-mei，E-mail:emliu186@126.com

ObjectiveTo describe the epidemiological and clinical features in hospitalized children with acute respiratory infection caused by novel swine-origin influenza virus and seasonal influenza virus A in Chongqing. MethodsA total of 1 074 nasopharyngeal aspirates were collected in hospitalized children with acute respiratory tract infection enrolled in the department of respiratory medicine in Children's Hospital of Chongqing Medical University from June 2009 to May 2011.The RNA of S-OIVs /seasonal IVA in the sample was examined using real time PCR. Clinical data were recorded and analyzed.ResultsThe presence of IVA was detected in 105 (9.8%) samples of 1 074 cases, including S-OIVs in 15 (1.4%) samples and seasonal IVA in the rest of samples (8.4%). No differences in gender, age and average inpatient hospital stay were found between patients with S-OIVs infection and seasonal IVA infection. ①The prevalence of S-OIVs was 73.3% (11/15)in summer of 2009, and the incidence of seasonal IVA infection was higher in the summer of 2009 (26/95,27.4%), summer of 2010 (22/95,23.2%) and spring of 2011 (25/95,26.3%). The incidence of both two viruses infection was lower in autumn and winter of 2009-2010. ②The rate of severe pneumonia in patients with S-OIVs and seasonal IVA infection was 1/15(6.7%) and 14/90(15.6%). There were no significant differences in clinical manifestation, white cell counts, CRP level between S-OIVs and seasonal IVA positive cases. 14 of 90 seasonal IVA positive cases were with severe pneumonia and 1 of 15 S-OIVs positive cases was with severe bronchiolitis. ③Five samples were found with single S-OIVs infection among 15 S-OIVs positive cases, other respiratory viruses were detected in 9 samples. Twenty one samples were found to be single seasonal IVA postive among 90 seasonal IVA positive cases, other respiratory viruses were detected in 42 samples. ④Multivariate logistic regression analysis showed that underling heart medical condition (OR=13.60), wheezing (OR=6.82) and co-infection with adenovirus (OR=6.21) were the risk factors of developing severe pneumonia in patients with seasonal IVA infection. ConclusionThe study indicated that the detection rate of S-OIVs infection and seasonal IVA was 1.4% and 8.4% respectively, in hospitalized children with acute airway respiratory infection in Chongqing. Children younger than 2 years old appeared to be susceptible to both virus infections. Diagnosis of non-severe respiratory tract infection was mainly presented in hospitalized patients with S-OIVs and IVA infection in the respiratory medicine division of our hospital. Underling heart medical condition, symptom of wheezing, and co-infection with adenovirus increase the risk of developing severe pneumonia in patients with seasonal IVA infection.

Swine-origin influenza A H1N1 virus; Seasonal influenza virus A; Children; Acute respiratory traction infection

云南及周邊省市區(qū)傳染病病原譜流行規(guī)律研究：2012zx10004212

重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院 重慶，400014

劉恩梅，E-mail:emliu186@126.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2014.03.005

2014-03-07

2014-05-25)