非小細(xì)胞肺癌中EMT的發(fā)生機(jī)制及預(yù)后價(jià)值的研究進(jìn)展

曹勤琛 趙路軍 王平

肺癌在男性的腫瘤相關(guān)性死亡中占首位，在女性的腫瘤相關(guān)性死亡中占第二位，目前已成為世界范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)性死亡的主要原因之一[1]。非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的85%，其中肺腺癌在NSCLC中所占的比例呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。盡管近些年來診斷和治療手段得到了不斷的改進(jìn)，但是NSCLC患者的5年生存率（約15%）卻未得到明顯提高。轉(zhuǎn)移是NSCLC患者的主要死因之一。但是，腫瘤細(xì)胞的具體轉(zhuǎn)移機(jī)制仍然不是十分明確[2]。近期研究[3-6]發(fā)現(xiàn)，NSCLC等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移與上皮細(xì)胞-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）的發(fā)生密切相關(guān)。

1 EMT的定義與鑒別

傳統(tǒng)的研究是從形態(tài)學(xué)上區(qū)分上皮細(xì)胞和間葉細(xì)胞[7]，因此，EMT往往被簡(jiǎn)單定義為從形態(tài)規(guī)則的上皮細(xì)胞向形態(tài)不規(guī)則的間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。典型的肺上皮細(xì)胞彼此之間連接緊密，排列也十分規(guī)則[8]。上皮細(xì)胞還具有頂面和基底面之分，這種特征被定義為上皮細(xì)胞的“極性”。上皮細(xì)胞的兩種不同表面與不同的基質(zhì)相連。上皮細(xì)胞間的這種排列方式能夠阻止上皮細(xì)胞從組織中脫離。肺的間葉細(xì)胞恰恰相反[9]。間葉細(xì)胞間的連接十分不緊密，排列方式也十分不規(guī)則。間葉細(xì)胞的外形十分瘦長(zhǎng)，這種形態(tài)有利于間葉細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。因此，間葉細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)比上皮細(xì)胞活躍，二者的運(yùn)動(dòng)方式十分不同。

分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)EMT發(fā)生的過程不僅是細(xì)胞形態(tài)的改變，還伴隨著相關(guān)分子標(biāo)記物的改變。例如，E-cadherin僅在上皮細(xì)胞中表達(dá)，而不在間葉細(xì)胞中表達(dá)[10]。因此，Hay[11]將EMT定義為細(xì)胞逐步喪失上皮細(xì)胞標(biāo)志物，同時(shí)逐步獲得間葉細(xì)胞標(biāo)志物的過程。其中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物包括E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、斑珠蛋白（plakoglobin）、細(xì)胞角蛋白（cytokeratins）等，而間葉細(xì)胞標(biāo)志物包括N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α smooth muscle actin,α-SMA）等。因此，應(yīng)該至少?gòu)男螒B(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩個(gè)方面鑒別某種腫瘤是否發(fā)生了EMT。

2 EMT的發(fā)生機(jī)制

腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT需要一定的誘因，而引起EMT發(fā)生的誘導(dǎo)因子可分為內(nèi)源性的和外源性的。其中，內(nèi)源性誘因包括某些基因的突變或過表達(dá)。突變后能夠?qū)е翬MT發(fā)生的基因包括p53等[12]；過表達(dá)后能夠?qū)е翬MT發(fā)生的基因包括K-ras、c-myc和RGC32等[13-15]。這些基因發(fā)生異常后不但能夠使細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變[13]，而且還能夠下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)[12]，同時(shí)上調(diào)間葉細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)[14,15]。外源性誘因包括吸煙、乏氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor, HIF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor β, TGF-β）等多種因素[16-18]。其中，吸煙能夠通過上調(diào)淋巴樣增強(qiáng)因子1（lymphoid enhancer factor 1, LEF1）和轉(zhuǎn)錄因子Slug，募集組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase, HDAC），進(jìn)而抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生[16]。HIF-2α能夠在mRNA水平上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Zeb1以及間葉細(xì)胞標(biāo)記物vimentin的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生[17]。TGF-β能夠通過Smad依賴性信號(hào)通路[19]或非Smad依賴性信號(hào)通路[20]抑制上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物E-cadherin等的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)間葉細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物N-cadhein等的表達(dá)。

如上所述，某些轉(zhuǎn)錄因子也參與了EMT的發(fā)生。與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制因子大致可分為兩類：一類能夠直接抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄和活性，如Snail1、Snail2和E47等[21]；另一類間接抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，如Twist等[22]。值得注意的是，Snail可以通過抑制清道夫受體A5（scavenger receptor class A member 5, SCARA5）的表達(dá)促進(jìn)NSCLC發(fā)生EMT，這一機(jī)制與其他腫瘤不太相同[23]。目前，Snail是否必須受上游信號(hào)的調(diào)節(jié)才能夠激活EMT尚無定論，仍然需要進(jìn)一步研究。

NSCLC發(fā)生EMT不僅僅與誘導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，還與某些信號(hào)通路密切相關(guān)。Hedgehog通路是在研究果蠅胚胎時(shí)首次被發(fā)現(xiàn)的，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲密切相關(guān)，對(duì)NSCLC細(xì)胞的存活十分關(guān)鍵[24,25]。這一通路中關(guān)鍵的效應(yīng)分子包括Gli轉(zhuǎn)錄因子等鋅指蛋白。Gli1能夠迅速促進(jìn)Snail的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)NSCLC發(fā)生EMT[25]。Mizuarai等[26]研究發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白S6激酶p70S6K2是Gli的下游效應(yīng)分子。通過抑制p70S6K2可以抑制NSCLC細(xì)胞系中Hedgehog通路的激活。Maitah等[27]研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog通路還可以與其他通路共同作用，比如通過上調(diào)配體Shh可以增強(qiáng)TGF-β對(duì)EMT的誘導(dǎo)作用。因此，Hedgehog通路既可以直接導(dǎo)致NSCLC發(fā)生EMT，也可以聯(lián)合TGF-β等其他通路間接促進(jìn)NSCLC發(fā)生EMT。并且，Hegehog通路促進(jìn)NSCLC發(fā)生EMT的具體機(jī)制比既往的研究復(fù)雜得多，需要進(jìn)一步深入的研究。

環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase 2, COX-2）是一種誘導(dǎo)酶，能夠催化花生四烯酸和類花生酸前列腺素合成，具有抗凋亡、促增殖、促進(jìn)EMT發(fā)生的作用，與NSCLC患者的預(yù)后密切相關(guān)[28]。前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）是COX-2的一種代謝產(chǎn)物，能夠促進(jìn)免疫抑制、誘導(dǎo)肺癌中EMT的發(fā)生[29]。在COX-2/PGE2通路中，PGE2通過上調(diào)Zeb1和Snail進(jìn)而促進(jìn)EMT的發(fā)生[30]?；谝陨侠碚摚芯咳藛T研發(fā)出了一些COX-2抑制劑（如阿利考西），希望借此能夠治療NSCLC[31]。但是近期的研究[32]發(fā)現(xiàn)，并非所有的COX-2抑制劑都能夠逆轉(zhuǎn)EMT。有些COX-2抑制劑，如塞來昔布（celecoxib）反而能夠促進(jìn)EMT的發(fā)生。因此，在研制和應(yīng)用COX-2抑制劑時(shí)應(yīng)當(dāng)十分慎重。

與EMT相關(guān)的TGF-β通路可分為兩種：一種需要轉(zhuǎn)錄因子Smad參與[19]，而另一種不需要Smad參與[20]。在Smad依賴性TGF-β通路中，TGF-β首先與受體結(jié)合，激活的TGF-β受體I促使轉(zhuǎn)錄因子Smad2和Smad3發(fā)生磷酸化，發(fā)生磷酸化的Smad2、Smad3與Smad4結(jié)合形成三聚物[19]。這種三聚物再被轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子一起調(diào)節(jié)TGF-β靶基因（如E-cadherin基因）的表達(dá)[19]。但是，Chen等[20]發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)NSCLC發(fā)生EMT往往是通過PI3K/Akt通路和MEK/Erk1/2通路等不依賴Smad的通路進(jìn)行的。

此外，核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）通路、Notch通路和Wnt通路也能促進(jìn)EMT的發(fā)生。但是，多項(xiàng)研究[33-37]表明這些通路主要促進(jìn)乳腺癌等其他腫瘤發(fā)生EMT。在NF-κB通路中，NF-κB能夠通過激活Twist和Snail促進(jìn)EMT的發(fā)生[34,38]。有研究[33]還發(fā)現(xiàn)，包括Ras在內(nèi)的許多EMT相關(guān)基因的激活是通過NF-κB通路進(jìn)行的。這說明NF-κB通路可能遠(yuǎn)比目前的研究結(jié)果復(fù)雜，仍需要更進(jìn)一步研究。在Notch通路中，轉(zhuǎn)錄因子Jagged1和Notch1的過表達(dá)可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達(dá)，而Slug通過抑制E-cadherin的表達(dá)、激活β-catenin以及抵抗失巢凋亡來促進(jìn)EMT的發(fā)生[39]。Sahlgren等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，Notch能夠誘導(dǎo)HIF-1α向賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase, LOX）聚集，進(jìn)而增強(qiáng)乏氧介導(dǎo)的LOX上調(diào)，而LOX具有穩(wěn)定Snail（Slug）蛋白的作用。因此，他們認(rèn)為Notch通路可以通過介導(dǎo)乏氧刺激EMT的發(fā)生[35]。在Wnt通路中，Wnt蛋白能夠與Frizzled受體結(jié)合，進(jìn)而在Frizzled受體、脂蛋白受體相關(guān)性蛋白（lipoprotein receptor related protein, LRP）、Dishevelled分子和軸抑制蛋白（Axis inhibition protein, Axin）之間形成一種穩(wěn)定的受體復(fù)合物，使Dishevelled分子發(fā)生磷酸化[36]。磷酸化的Dishevelled分子會(huì)抑制GSK-3β活性，而GSK-3β又具有促使轉(zhuǎn)錄因子Snail1發(fā)生磷酸化的作用[37]。這樣，Snail1就會(huì)在細(xì)胞中不斷積累，最終促使EMT的發(fā)生[37]。目前仍需要大量研究證實(shí)NSCLC是否也能夠通過這些通路發(fā)生EMT。

3 EMT與miRNA

miRNA（或microRNA）是一種長(zhǎng)度為20個(gè)-22個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA），能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[40]。在EMT相關(guān)的miRNA中，miR-200被研究得最多[41]。miRNA-200能夠下調(diào)Zeb1 mRNA和Zeb2 mRNA的水平，上調(diào)E-cadherin水平[42]，抑制EMT的發(fā)生，進(jìn)而抑制NSCLC的轉(zhuǎn)移[43]。最近的研究[44]發(fā)現(xiàn)，MiR-134/487b/655能夠通過抑制膜相關(guān)性鳥苷酸激酶的活性進(jìn)而抑制肺腺癌中EMT的發(fā)生，減少肺腺癌對(duì)吉非替尼的耐藥性。而miR-30a能夠下調(diào)Snail的表達(dá)進(jìn)而影響NSCLC細(xì)胞中E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)水平[45]。但是，Kong等[46]發(fā)現(xiàn)，TGF-β在誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的同時(shí)還能夠促進(jìn)miR-155的表達(dá)。降低細(xì)胞中miR-155水平反而能夠抑制EMT的發(fā)生、抑制細(xì)胞間緊密連接的降解，進(jìn)而抑制細(xì)胞的侵襲性。反之，增加miR-155水平能夠促進(jìn)EMT的發(fā)生，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲性。NSCLC中是否也存在這種現(xiàn)象仍然不十分清楚。這說明miRNA調(diào)節(jié)EMT發(fā)生的機(jī)制不盡相同。

既然miRNA能夠抑制EMT而EMT又與NSCLC的轉(zhuǎn)移相關(guān)，那么miRNA能否有效地預(yù)測(cè)NSCLC的預(yù)后呢？Gao等[47]發(fā)現(xiàn)miR-21的高表達(dá)（HR=5.993, 95%CI:2.518-14.264; P＜0.001）、miR-181a的低表達(dá)（HR=0.328,95%CI: 0.142-0.756; P=0.009）與患者的總生存期密切相關(guān)，而與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)。Li[48]的研究也發(fā)現(xiàn)miR-146的高表達(dá)與NSCLC患者的預(yù)后密切相關(guān)，而與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)?？梢?，miRNA與NSCLC的總生存期相關(guān)，而其預(yù)后價(jià)值仍需要更深入的研究。

4 EMT與腫瘤干細(xì)胞

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells, CSC）是能夠自我更新并能夠分化成多種腫瘤細(xì)胞系的一類細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞理論最初只是一種設(shè)想，直到1997年首次通過實(shí)驗(yàn)證明腫瘤干細(xì)胞的存在[49]。Mani等[50]首次報(bào)道了EMT的發(fā)生能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞成為腫瘤干細(xì)胞。他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過球體培養(yǎng)的上皮細(xì)胞可以向干細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并且能夠獲得間葉細(xì)胞的某些表型[50]。Pirozzi等[51]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過TGF-β1處理的NSCLC細(xì)胞系不但發(fā)生了EMT，還能夠表達(dá)腫瘤干細(xì)胞的某些分子標(biāo)記物，如Oct4、Nanog、Sox2、c-kit和CD133等。因此，我們推測(cè)，所謂EMT或許就是上皮細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的一個(gè)過程。如果這一猜想成立的話，那新的問題出現(xiàn)了：既然腫瘤干細(xì)胞是能夠自我更新并能夠分化成多種腫瘤細(xì)胞系的一類細(xì)胞，那腫瘤干細(xì)胞的分化是否也能夠?qū)е翬MT的發(fā)生。這些猜想尚需要大量的研究證實(shí)。

5 EMT與NSCLC預(yù)后的相關(guān)性

目前，有關(guān)EMT與NSCLC預(yù)后的研究多數(shù)是從相關(guān)標(biāo)記物的臨床意義入手的。與EMT相關(guān)的分子標(biāo)志物包括上皮細(xì)胞標(biāo)志物以及間葉細(xì)胞標(biāo)志物、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等[6,11]。

E-cadherin是上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，表達(dá)水平在EMT的發(fā)生過程中逐漸降低[11]。Sulzer等[4]發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)情況與NSCLC患者的預(yù)后密切相關(guān)。111例接受手術(shù)的患者中，高表達(dá)E-cadherin的患者的3年生存率是60%，而低表達(dá)E-cadherin的患者的3年生存率僅32%。但是，Tarin[52]通過回顧文獻(xiàn)及自己既往的研究后認(rèn)為EMT在腫瘤的進(jìn)展中并不一定具有意義。Prudkin等[53]發(fā)現(xiàn)：E-cadherin表達(dá)的減少和N-cadherin的過表達(dá)與肺癌的預(yù)后不相關(guān)，且?guī)缀跛械姆伟?biāo)本都存在EMT表型的變化。他們還發(fā)現(xiàn)，與肺癌的原發(fā)灶相比，腦轉(zhuǎn)移瘤能夠表達(dá)更高水平的E-cadherin[53]。Wu等[5]對(duì)13項(xiàng)研究中的2,274例患者進(jìn)行了meta分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin的下降確實(shí)與NSCLC患者的預(yù)后相關(guān)，但是與I期患者的預(yù)后無關(guān)。

因此，EMT相關(guān)標(biāo)志物與NSCLC患者預(yù)后的具體關(guān)系需要進(jìn)一步研究及更加深入的分析，而首先需要解決的問題是篩選更多可供肺癌研究借鑒的相關(guān)標(biāo)記物。例如，N-cadherin和Vimentin是間葉細(xì)胞特異性標(biāo)志物，其表達(dá)水平在EMT的發(fā)生過程中逐漸增加[11]，同樣可以作為檢測(cè)EMT發(fā)生的特異性指標(biāo)。Luo等[54,55]發(fā)現(xiàn)胞核中N-cadherin和Vimentin的陽(yáng)性表達(dá)率與鼻咽癌患者的臨床分期相關(guān)（P＜0.001）。既然如此，N-cadherin和Vimentin與NSCLC的臨床分期是否也存在一定的相關(guān)性呢？Hui等[6]發(fā)現(xiàn)III-IV期與I期和II期NSCLC中N-cadherin的表達(dá)陽(yáng)性率分別為39.58%、31.58%和23.53%（P＜0.01），而低、中、高分化NSCLC中N-cadherin表達(dá)陽(yáng)性率分別為64.10%、35.71%和16.0%（P＜0.01）。Dauphin等[56]發(fā)現(xiàn)Vimentin的高表達(dá)與NSCLC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.024）和較晚分期（P=0.002,8）相關(guān)?？梢?，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)情況與NSCLC的分期同樣存在一定的相關(guān)性。

轉(zhuǎn)錄因子在EMT的發(fā)生過程中有十分重要的調(diào)控作用，那么通過檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況應(yīng)該可以明確EMT的發(fā)生情況及其預(yù)后價(jià)值。Yin等[57]對(duì)107例骨肉瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中Twist的陽(yáng)性表達(dá)率為31.8 %（34/107） ，并且Twist表達(dá)陽(yáng)性的骨肉瘤患者在總生存期和無進(jìn)展生存期方面均較差（P＜0.05）。類似地，Hui等[6]發(fā)現(xiàn)NSCLC中Twist的表達(dá)陽(yáng)性率為38%，明顯高于瘤旁正常組織（P＜0.01）。并且，Twist的表達(dá)情況與NSCLC的分期和分級(jí)相關(guān)。III期-IV期NSCLC中Twist的表達(dá)率（56.25%）明顯高于I期（21.05%, P＜0.01）或II期（32.35%, P＜0.01）。低分化癌與中分化和高分化癌中Twist的表達(dá)陽(yáng)性率也各不相同，分別為66.67%、26.79%和20.00%（P＜0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中Twist的表達(dá)情況也存在一定的差異（48.58% vs 24.0%, P＜0.01）。這說明，Twist對(duì)NSCLC同樣具有預(yù)后意義。但是，Twist的過表達(dá)并不是NSCLC的獨(dú)立預(yù)后因素，與N-cadherin的過表達(dá)呈一定的相關(guān)性（R=0.565, P＜0.001）[6]。

盡管上述的研究表明EMT相關(guān)的標(biāo)記物與NSCLC患者的預(yù)后存在一定相關(guān)性，但這些研究?jī)H僅是從分子生物學(xué)方面對(duì)EMT進(jìn)行研究。既然EMT的鑒別至少需要從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩個(gè)方面進(jìn)行，那么研究人員也應(yīng)該將形態(tài)學(xué)因素考慮在內(nèi)。

6 問題與展望

目前，有關(guān)EMT的研究雖然取得了一定的成果，但仍然面臨許多問題。首先，多數(shù)研究表明EMT相關(guān)標(biāo)志物與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈一定的相關(guān)性，但這些研究并未證明EMT與腫瘤進(jìn)展是否真的存在一定的順序關(guān)系或因果關(guān)系。Chui[58]認(rèn)為，累積的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變以及腫瘤微環(huán)境才是導(dǎo)致腫瘤獲得侵襲性的重要因素，而EMT并非腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的必要步驟?？梢?，EMT與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系尚存在一定的爭(zhēng)論，仍需要深入的研究。其次，EMT相關(guān)基礎(chǔ)研究應(yīng)該不斷地應(yīng)用于臨床。例如，Brachyury是最近發(fā)現(xiàn)的一種T-box轉(zhuǎn)錄因子，能夠在多種腫瘤中表達(dá)[59]。Brachyury的高表達(dá)能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。針對(duì)這種轉(zhuǎn)錄因子，研究人員研發(fā)出了一種腫瘤疫苗，希望能夠用這種疫苗治療晚期NSCLC[60]。因此，在解決相關(guān)爭(zhēng)論的同時(shí)，不斷將EMT與NSCLC的免疫治療相結(jié)合或許是未來的研究方向之一。